Enzimológia Lipáz enzimek

(1)

Enzimológia Lipáz enzimek

Dr. Barta Zsolt

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem

Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék 22-07-25

(2)

2

Lipidek

Mi a lipid?

 zsírsavak és származékaik (gliceridek és foszfolipidek)

 zsírok (trigliceridek), viaszok

 szteránvázas metabolitok (koleszterin) Funkciójuk

 energia tárolás

teljes oxidációjukkor kb. 9000 kcal/kg energia szabadul fel (szénhidrátból/proteinből kb. 4000 kcal/kg)

 szignál molekulák

 zsíroldható vitaminok (A, D, E, K) tárolása Jellemzőjük

 hidrofób vagy

 amfipatikus:

hidrofil (víz-kedvelő) és lipofil (zsír-kedvelő)

 vezikulumok, liposzómák, membránok

Lipids

a foszfolipidek amfipatikus jellege

(3)

7

Glicerolipidek

Felépítésük

 mono-

 di-

 triszubsztituált glicerin

 Fischer képletben:

a középső C atomon lévő zsírsav balra áll felül lévő C atom sn-1, alul lévő C atom sn-3 Trigliceridek / Triglycerides

 glicerin észtere 3 zsírsavval

 3 azonos / különböző alkillánc

 alkillánc hossza változó,

leggyakoribb: 16, 18, 20 C-atom

 természetes növényi és állati zsírsavak:

jellemzően páros számúak, mert

szintézisük során az acetil-CoA 2 C-atomos acetát-csoportokat képes szállítani

 baktériumok képesek páratlan C-atomszámú és elágazó láncú zsírsavak előállítására kérődzők zsírja is tartalmaz ilyet

 zsírok / olajok: trigliceridek keveréke

Glycerolipids

http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/tag1/index.htm

(4)

8 foszfolipid

Foszfolipidek / foszfatidok

Felépítésük

 glicerin +

 2 zsírsav +

 foszforsav +

 1 N-t tartalmazó molekula (alkohol észteresíti a foszfatidsavat) Jellemzőik

 amfipatikus vegyületek (víz & apoláris kh.) amfipatikus vegyületek

 vizes közegben cseppek/vékony hártyák sejtmembrán építőkövek

 foszfatidsav: más foszfatidok alapvegyülete

 ammónium-foszfatidok: élelmiszerekben (csokoládé- és kakaótart.)

E442 néven emulgeálószer emulgeálószer

Glycerophospholipids / phospholipids

glicerin-3-foszfát

foszfatidsav

(5)

9

Foszfolipidek / foszfatidok

Technikai lecitin

 sárgás-barnás zsíros anyag

glikolipidek, trigliceridek, foszfolipidek keveréke

 előfordulása

állati és növényi szövetekben, tojássárgájában (lekithos ógörögül)

 kinyerése

napraforgó olaj nyálkátlanítása

→ nyálka üledék (olaj, víz, lecitin) bepárlása

 élettani hatása

koleszterin-csökkentő (jó koleszterinszint növelő) kötött P- és B vitamin (B8 és B11)-tartalom

jó hatás az idegrendszerre, agyműködésre, memóriára

a vastagbélben támogatja a Lactobacillus és Bifidobacterium fajok elszaporodását

 felhasználása

tartósító- (antioxidáns hatás), emulgeáló-, stabilizálószer - E322 margarin-, csokoládégyártás, sütőipar

takarmányipar (zsíradék, pelletképzés-javító)

festékipar (stabilizáló, emulgeáló, rozsdaképződést gátló, színélénkítő)

Glycerophospholipids / phospholipids

foszfatidil-kolin / foszfátkolin

(6)

10

Lipázok

Jellemzőik

 lipidek észter-kötésének hidrolízisét katalizálják

 egyensúlyi reakció kis vízkoncentráció: katalizálják az alkoholok és savak észterképzését (lipid szintézis)

 legtöbb mikrobiális lipáz mezofil, optimális körülményeik: pH 7-9, 30- 40°C

termofilek: potenciális ipari jelentőség

 Nem igényelnek kofaktorokat (ez jellemző a hidrolázokra is)

 Affinitás csökken a di- és monogliceridek esetén

Lipases



(7)

Lipázok vs. észterázok

 Határfelületi enzimek: az aktív centrumot borító „fedél” határfelület hatására felnyílik 

határfelületi aktiváció (azonban nem mindenhol teljesül ez, így más megközelítésben 10 C atom szám feletti zsírsavakat tartalmazó lipidek hidrolízisét és szintézisét katalizáló észterázok)

11

VERGER, R; DEHAAS, GH. ANNUAL REVIEW OF BIOPHYSICS AND BIOENGINEERING Volume: 5 Pages: 77-117 Published: 1976

Reakciósebesség a szubsztrátkoncentráció függvényében

máj észteráz és hasnyálmirigy lipáz esetén triacetin szubsztráton

Az észterázok Michaelis-Menten kinetikát követnek, és oldatban lévő szubsztráton hatnak

A lipáz aktivitás ugrásszerűen nő, ha a triacetin oldhatóságát

meghaladja a szubsztrátkonc. (a telítettség >1)  két fázis van jelen, és a lipáz a közöttük lévő határfelületen aktív

(8)

12

Lipázok

Reakcióik

 észter hidrolízis

 észter szintézis

 átészterezés alkohollal észterrel savval

Lipases

Salleh et al. (Eds), New lipases and proteases, 2006

(9)

pH-stat módszer



Az észterek hidrolízisének követésére  hidrolízis kinetika vizsgálatára



Enzimaktivitás méréshez szintén használható



A pH-t mérhetjük pl. üvegelektróddal, vagy indikátorok alkalmazásával



A lipázok aktivitásmérését is leggyakrabban pH-stat segítségével valósítják meg



Állandó pH-t tartanak lúgoldat hozzáadásával



Ebben az esetben legtöbbször tributirint (a glicerin vajsav-észterét ) használnak szubsztrátként, de jellemző az olivaolaj emulzió is



A pH ilyen méréseknél jól követhető üvegelektróddal, mivel a

felszabaduló vajsav vízoldható és az NaOH oldattal jól mérhetően titrálható.



Mikor van vége az enzimes reakciónak?



Hogyan számítható a konverzió ismert mennyiségű tributirint tartalmazó reakcióelegy esetén?

14

(10)

Lipid-víz kétfázisú rendszerek



I. Lipid emulzió

A hidrofób tulajdonságok dominálnak



II. a) Lipid kettősréteg és b) Liposzóma Megjelenik töltés a molekulában

Pl. foszfolipidek



III. Micella

Egyre polárosabb a molekula Rövidebbek a zsírsavláncok

Kis koncentrációban teljesen oldatban vannak

CMC (kritikus micella koncentráció) felett gömb v.

pálca, de optikailag tiszta a folyadék, gyors egyensúly Pl. detergensek

15

(11)

Lipáz kinetika

 Lipid emulzió a szubsztrát

 Formailag a Michaelis-Menten kinetikához hasonló, de fontos eltérés a felületen történő adszorpció

 Üres kör: kis zsírcseppek, teli kör: nagy zsírcseppek

 „Felületi szubsztrátkoncentráció” esetén illeszkednek egy egyenesre

16

1/S

S: anyagmennyiség/térfogat

1/S_A

S_A: felület/térfogat

(12)

17

Lipázok ipari felhasználása

Ipari felhasználás területei

 régió- és sztereospecifikusak lehetnek, vagy szelektívek lánchosszra, kettős kötés helyzetére

 mosószerek

 tejipar

 olajkémia (pl. biokenőanyag, szappanok eá.)

 gyógyászat

 kozmetikai ipar

 sütőipar (javítja a tészta állagát, szerkezetét)

 bőripar

 bioremediáció

 biodízelgyártás

 Szennyvízkezelés, biogáz előállítás

Industrial uses of lipases

(13)

20

Tisztítószerek

Detergensek / Detergents

 követelmények

lúgos környezetben aktív kis szubsztrát specificitás

kompatibilitás a detergensekkel

 teljes lipáz termelés kb. 1/3-a

 kereskedelemben 1988- (Lipolase - Novo Nordisk)

 ipari és háztartási mosó-

mosogató-

egyéb tisztítószerekben

 Mosás után a szárítás során a lipáz aktivitás jelentősen nő (következő dia, jobb ábra).

Oka: 20-30% nedvességtartalmú szövet az optimális az enzimműködéshez.

A folteltávolítás a következő mosás során hatékonyabb (következő dia, bal ábra).

Detergents

(14)

21

Tisztítószerek

Detergents

Mosási ciklusok száma

Tiszta szövet

3000 U/l, szennyezett szövet 1000 U/l, szennyezett szövet 300 U/l, szennyezett szövet 0 U/l, szennyezett szövet

Wolfgang Aehle (ed.) Enzymes in industry: production and applications, 2004

(15)

22

Tejipar - sajtgyártás

Tejipar / Dairy industry

 joghurtgyártás

 sajtgyártás / cheese making, ripening vajzsír és tejszín bontása

érés gyorsítása

ízfokozás (főleg lágy sajtok jellegzetes ízének kialakítása)

۰ lipáz  rövid láncú zsírsav (ált. C4, C6) felszabadítása  erős, csípős íz ۰ lipáz  közepes lánchossz (C12, C14)  zsírosabb íz

۰ lipázok részt vesznek egyszerű kémiai reakciókban  egyéb ízanyagok íz imitálás

۰ utánozza a juh / kecske sajtok ízét  feta és egyéb sajtok tehéntejből

۰ pasztőrözött tejből való sajtgyártásnál a nyers tejből előállítotthoz hasonló ízt ad EMC: enzim-módosított sajtok (USA)

۰ a sajtot enzimmel termosztálják magas hőfokon

 10x nagyobb zsírsavkonc.

 szószokhoz, saláta-öntetekhez, levesekhez, rágcsálnivalókhoz

Dairy industry – cheese making

(16)

24

Olajkémia

oktatas.ch.bme.hu/oktatas/konyvek/mezgaz/Biotermektech/BSc/Ipari enzimek 2.pdf

Oleochemical industry

Sztearinsav hozzáadása és kis vízaktivitású közeg (szerves oldószer)

(17)

Olajok enzimes nyálkátlanítása

 Foszfolipáz A1 (sn-1 zsírsav hidrolízise), A2 (sn-2 zsírsav hidrolízise), C (foszfát csoporttól „balra”) és D (foszfát csoporttól „jobbra”)

 Ipari alkalmazása az A2-nek van (eredetileg sertés hasnyálmirigy eredetű, de később mikrobiális termelés is)

 Szűrésnél a nyálka gondot okoz

 célszerű a nyálka (emulgeálószer) enzimes bontása, ezzel csökken az amfipatikus jelleg

 EnzyMax folyamat

pH 5.0, 60°C, 1-6 h (foszfatidtartalomtól és a termékminőségtől függ)

26

Casimir C. Akoh, David B. Min. Food Lipids: Chemistry, Nutrition, and Biotechnology, Third Edition Food science and technology. CRC Press, 2008

(18)

Biogázosítás – lipid hidrolízis

 Az olajok és zsírok közvetlen beadagolva a biogázosító reaktorba

rátapadhatnak a bakteriális ökoszisztémát adó aggregátumok, flokkulumok felületére, gátolva ezzel az anyagtranszportot a vizes fázis és a szilárd gátolva ezzel az anyagtranszportot

részecskék között.

 Még ennél is kifejezettebb az az irreverzibilis gátlóhatás, amit az olajok és zsírok hidrolízisénél felszabaduló hosszúláncú zsírsavak – különösen a

telítetlen zsírsavak – okoznak, beépülve egyes baktériumok membránjaiba, beépülve egyes baktériumok membránjaiba véglegesen meggátolva azok normális fiziológiai működését.

 A metanogén baktériumok erősen gátolhatók hosszúláncú zsírsavakkal.

Állattenyésztők

Állattenyésztők ki is használják ezt a jelenséget: a takarmányhoz adagolva azokat nagymértékben csökkenthető a kérődzők metántermelése.

 Másrészről a zsírsavak biogázosítása kb. 3-szor annyi energianyeréssel jár, 3-szor annyi energianyeréssel mint a szénhidrátoké!

28

(19)

Biogázosítás – lipid hidrolízis

 Az olajok és zsírok gyors hidrolízisét és ezáltal a gátló hosszúláncú zsírsavak felszaporodását a biogázosító reaktorban megakadályozni nem tudjuk, mivel a reaktorban jelentős lipáz aktivitás figyelhető meg, ezáltal a hidrolízis a hidrolízis

sebessége sokkal nagyobb, mint a

sebessége sokkal nagyobb, mint a biobiogázképzés sebessége.gázképzés sebessége

 A hosszúláncú zsírsavak Ca-sóihosszúláncú zsírsavak Ca-sói nem okoznak a fentiekhez hasonló gátlást, mivel oldhatóságuk vízben minimális. Ekvimoláris mennyiségû Ca²⁺ szükséges a kívánt hatás eléréséhez,vagyis ha a hosszúláncú zsírsav (LCFA) és a Ca²⁺

mólarányát fejezzük ki, akkor ha ez az arány :

[LFCA] / [Ca] = 2 ,vagy ennél kisebb, akkor nincs gátlás.

 Ugyanakkor CaCO₃ adagolása nem csökkenti a gátlóhatást. Miért?

29

(20)

Biogázosítás – lipid hidrolízis

 Először megvizsgáltuk, hogy követhető-e a lipázos hidrolízis 3 fázisú (víz-olaj- oldhatatlan zsírsav-Ca sók) rendszerben manuális pH-stat módszerrel pH pH

(üveg) elektróddal (üveg) elektróddal.

 CaO zavarCaO zavar..

 Fenolftalein: Ezért az újabb kísérletünkben először ismert mennyiségű CaO-ot Fenolftalein adtunk a rendszerhez. Ennek hatására a fenolftalein lilaszínűre váltott.

Mértük azt az időt, ami az adott mennyiségű CaO elfogyásához szükségeltetett az időközben képződött zsírsavak hatására.

 A fordulatszámfordulatszám nagymértékben befolyásolja a hidrolízis sebességét. Miért?

30 0

20 40 60 80 100 120

7 8 9 10 11

pH Aktivitás

(%)

A Novozyme 871 lipáz enzim aktivitásának pH-függése

(21)

31

0 200 400 600 800 1000 1200

0 5 10 15 20 25 30

Reakcióidő(min) CaO(mg)