Eltérően kifejeződő HMG-KoA reduktáz gének Mucor circinelloides-ben

Eltérően kifejeződő HMG-KoA reduktáz gének Mucor circinelloides- ^ben

Nagy Gábor, Farkas Anita, Csernetics Árpád, Vágvölgyi Csaba, Papp Tamás

Szegedi Tudományegyetem, Természettudományi és Informatikai Kar, Mikrobiológiai Tanszék

Mucor circinelloides ^{, mint} modellorganizmus

 járomspórás gomba

 http://genome.jgp-psf.org/Mucci2/Mucci2.home.html

 genetikai transzformálhatóság

 mutánsok

Mevalonsav útvonal

O

S C o A

O

S C o A

O

O H

O H O

S C o A

O H

O H

O H O

O H

O H

O P O

O H

O H

O P P O

O P P

acetil-KoA

aceto-acetil-KoA

HMG-KoA

mevalonsav

mevalonát-P

mevalonát-PP

izopentenil-PP acetil-KoA acetiltranszferáz

HMG-KoA szintáz

HMG-KoA reduktáz

mevalonát kináz

foszfomevalonát kináz

mevalonát-difoszfát dekarboxiláz

Izoprén bioszintézis útvonal

O P P

O P P

O P P

O P P

O P P

IPP (C5)

GPP (C10)

FPP (C15) DMAPP (C5)

GGPP (C20) isoA

carG

Monoterpének

Szteroidok

Farnezilált proteinek

Karotinoidok Geranilgeranilált proteinek

ipi

Csernetics és mtsi. 2011.

3-hidroxi-3-metilglutaril-koenzim A reduktáz

 2-8 transzmembrán domén – N-terminális (SSD)

 endoplazmatikus retikulum

 konzervált C-terminális

 Homo sapiens ^{– 1,} Saccharomyces cerevisiae ^{– 2,} Mucor circinelloides - 3

 Szerepet játszik:

 Oxigén érzékelés (Thorsness és mtsi. 1989, Casey és mtsi. 1992)

 Ozmotikus adaptáció (Horvath és mtsi.1998, Vaupotič és mtsi. 2008)

Célkitűzések

 3 HMG-KoA reduktáz gén (hmgR1^, hmgR2^, hmgR3⁾

 eltérő szabályozás

 izoprének keletkezése külön kompartmentekben (Vera Kuzina és mtsi.

2006)

 Célok:

 relatív transzkripciós szintek meghatározása

 gének izolálása, klónozása

 a gének csendesítése, elrontása

 HPLC-s mérések

Relatív transzkripciós szintek meghatározása

 RNScDNSreal-time PCR

 különböző tenyésztési körülmények

 idő függvényében

 só stressz hatása

 különböző szénforrás

 aerob/anaerob tenyésztés – dimorf gomba

Idő függvényében

4 8 24 48 72 96

0 10 20 30 40 50 60 70

Relatív transzkripciós szint

hmgR1 hmgR2 hmgR3

Leoltástól számított óra

80 90

Só stressz hatása

K 1% NaCl 2% NaCl 3% NaCl

0 50 Relatív transzkripciós szint 100

hmgR1 hmgR2 hmgR3

Táptalaj sótartalma

150 200 250 300 350 400 450 500

Különböző szénforrások hatása a gének kifejeződésére

dihidroxi- aceton glükóz maltóz trehalóz Na-acetát

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Relatív transzkripciós szint hmgR1

hmgR2 hmgR3

Aerob/anaerob tenyésztési körülmény

aerob anaerob anaerob + 1 óra aerob

5 10 15 20 25

30 35

0

Relatív transzkripciós szint

hmgR1 hmgR2 hmgR3

Gének klónozása

 expressziós vektorok

 PEG-mediált protoplaszt transzformáció

 M. circinelloides^{, MS12} leu^-, ura^- törzs

 transzformánsok izolálása

 autonóm replikatív elem

Plazmidok kimutatása

1000 bp 750 bp 500 bp

MS12+pNG1 MS12+pNG2 MS12+pNG3

pNG1 pNG2 pNG3

MS12 MS12 MS12

Transzformánsok összkarotin tartalma

összkarotin tartalom μg/g [száraztömeg]

MS12 MS12+

pNG1 MS12+

pNG2 MS12+

pNG3

0 200 400 600 800 1000

Törzsek

Sztatinok hatása a transzformánsokra

>256

>256 32-64

MS12+pNG3

>256 128-256

16-32 MS12+pNG2

32 16

2-4 MS12+pNG1

32 16

2-4 MS12

Rozuvasztatin Atorvasztatin

Fluvasztatin törzs/sztatin

Minimális gátló koncentráció (μg/ml)

A gének csendesítése

NotI XhoI 650-750 bp

5’ 3’

anti mRNS mRNS

dsRNS

géncsendesítés

5’ 5’

5’ 5’

3’ 3’

3’ 3’

NotI XhoI

gpdP gpdT

pAS1 6001 bp

XhoI

NotI

Amp.

pyrG gp

dP

gpdT

antis. hgm R1

pAS2 5965 bp

XhoI

NotI

Amp.

pyrG gp

dP

gpdT

antis. hmgR2

pAS3 6036 bp

XhoI

NotI

Amp.

pyrG gp

dP

gpdT

antis. hmgR3

Transzformáló vektorok

A kapott transzformánsok jellemzése

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

1nap 2nap 3nap 4nap

MS12 14 15 21 22 33

növekedés (mm) 34

10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap

MS12 pAS1 pAS2 pAS3

Leoltástól számított napok

A pAS3 vektor hatása

MS12

pAS3-4 pAS3-3

 csírázás

 növekedés

 sejtmag

Folyamatban lévő munkák és további tervek

 a kapott transzformáns törzsek jellemzése

 GFP

 a fő szterolkomponens (ergoszterol) mennyiségének HPLC-s mérése

 egyéb, az izoprén bioszintézis útról leágazó, termékek HPLC-s meghatározása

Összefoglalás

 megvizsgáltuk a gének kifejeződését különböző tenyésztési körülmények között

 klónoztuk a géneket, expressziós vektorokat hoztunk létre

 jellemeztük a transzformánsokat

 összkarotin tartalom, sztatinnal szembeni érzékenység vizsgálata

 megkezdtük a gének további funkcionális vizsgálatát

 hmgR2 általános izoprén bioszintézisért felelős

 hmgR3 karotinbioszintézis, morfogenezis, oxigén érzékelése

Köszönetnyilvánítás

 Prof. Dr. Vágvölgyi Csaba

 Dr. Papp Tamás

 Dr. Csernetics Árpád

 Dr. Szekeres András

 Bencsik Ottó

 Farkas Anita

 a 309-s labor dolgozói

 az SZTE-TTIK Mikrobiológiai Tanszék valamennyi munkatársa

 Jelen kutatási eredmények megjelenését „Az SZTE Kutatóegyetemi Kiválósági Központ tudásbázisának kiszélesítése és hosszú távú szakmai fenntarthatóságának megalapozása a kiváló tudományos utánpótlás biztosításával” című, TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0012 azonosítószámú projekt támogatja. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.

Köszönöm a figyelmet!