Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat kiselőadásKállai Brigitta2014. április 22. Bioszenzorok

(1)

Bioszenzorok

Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat kiselőadás Kállai Brigitta

2014. április 22.

1

(2)

Bioszenzorok

• Szenzorokkal mérhető és szabályozható paraméterek:

• oldott oxigén és szén-dioxid,

• pH,

• redoxpotenciál,

• hőmérséklet,

• habszint,

• keverés.

• Első fejlesztések:

• Biomassza meghatározása in situ optikai denzitás méréssel;

• Fejlődő gáz analízis;

• Illékony komponensek detektálása (pl. metanol).

• Bioszenzorok:

• Nem illékony szubsztrátok és metabolitok mérése;

• Egyetlen analitikum mérése még komplex mátrixokban is. ²

(3)

Bioszenzorok

• A mintavétel és analízis között eltelt idő összhangban kell legyen a folyamat idejével

• Baktériumok tenyésztése során pár perc,

• Lassabban szaporodó emlős sejtek esetében 1-2 óra,

• Immobilizált enzimet alkalmazó reaktor esetében pár másodperc.

• Alkalmazás:

• In situ (sterilizálás probléma);

• Szűrést követően (analízis körülményei nem egyeznek meg a fermentáció körülményeivel);

• Alternatíva: automata analizátorok (FIA, flow injection analysis)

3

Előnyök Hátrányok

Kisebb befertőződési veszély Membrán eltömődhet

Rövid válaszidő Minta hígítására szükség lehet Kis mintatérfogat elégséges pH beállítása analízis előtt Automatikus kalibráció Idővel szenzor inaktiváció

(4)

Bioszenzorok általános felépítése

4

Külső membrán pl. dialízis membrán

Jelátalakító (Transzducer) Biológiai érzékelő

(Biokatalizátor)

• Potenciometriás

• Amperometriás

• (Konduktometriás)

• Termikus

• Optikai

• Teljes organizmusok

• Szövetek

• Sejtek

• Organellumok

• Enzimek

• Antitestek S

P

JEL

Jelerősítés

PC

Jel:

pH-változás,

Felszabaduló gáz, Fényemisszió Tömegváltozás Stb.

(5)

Enzimek alkalmazása analitikai célra (BIM)

• Szubsztrát, mint analitikum

5

Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (98. oldal)

(6)

Enzimek alkalmazása analitikai célra (BIM)

• Ha nincs közvetlenül mérhető változás: indikátorreakció!

6 elnyelési max.

(7)

Enzimek

 Kvantitatív:

 Specifikus reakciók;

 Minimális mintaelőkészítés;

 Michaelis-Menten kinetika

 Szilárd felszínen történő rögzítés (immobilizációs stratégia)

 Cél:

 Az enzim lehető legmagasabb aktivitása

 Hosszú stabilitási idő

 Rögzítést követően kis távolság a jelátviteli egységtől

 Fizikai: gélbe zárás, adszorpció

 Kémiai: kovalens kötéssel, keresztkötéssel, immobilizáció polimer filmbe

7

(8)

Fizikai: gélbe zárás

 Gélképző polimerek pl. alginát, kitozán, akrilamid

 Enzimtartalmú oldat + nátrium-alginát összekeverése

 Csepegtetés Ca²⁺ ionokat tartalmazó pufferbe

 Kálcium-alginát nem oldódik vízben, a golyócskák bezárva tartalmazzák az enzimmolekulákat.

 Előny: bármilyen enzimre alkalmazható

 Hátrány:

 Frissen kell elkészíteni

 Lassú a szubsztrát/termék transzport, hosszú a reakcióidő

 Enzimek folyamatosan elvesznek (póruseloszlás miatt), csökken az enzimaktivitás

 Polimer szerkezete megváltozik (zsugorodhat/duzzadhat a környezet ionerősségétől függően)

8

(9)

Fizikai: adszorpció

9

Mi a probléma?

A modell nem veszi figyelembe a parciális telítettséget, ekkor a deszorpció kedvezményezett.

• Alkalmazás:

egyszer használatos szenzorok (nem igényelnek hosszú távú stabilitást)

• Előny: nincs szükség további reagensekre, minimális aktiváció

• Hátrány: gyenge kölcsönhatások → érzékeny a környezezet megváltozására (pH, hőmérséklet, ionerősség, polaritás)

• Modell: minden egyes a felülettel érintkező molekula

adszorbeálodik és koncentráció gradiens alakul ki.

(10)

Kémiai: kovalens kötéssel immobilizált enzim

 Előny: irreverzibilis (stabil)

 Kémiai kötés - a fehérje funkcióit nem befolyásoló aminosav oldalláncokkal (karboxil, hidroxil, tiol, imidazol, fenol)

I. Fémelektródokhoz

1)elektródfelület aktivációja: Fém + szilán → stabil –M-O-Si- kötés

2)enzim kötődése az aktivált elektród felülethez → amid kötés

• Aktivált enzim (BIM)

10

(11)

Kémiai: kovalens kötéssel immobilizált enzim

II. Szénelektródokhoz

1.Felületi hidroxil csoport + cianur-klorid (2,4,6-Triklór-1,3,5-triazin)

→ szerves oldószerekben és vizes oldatokban stabil éter-kötés

2.Cianur-klorid + hidroxil, amino csoport

Pl. torma peroxidáz rögzítése grafit részecskék felületéhez

11

(12)

Kémiai: keresztkötéssel

12

http://synapses.clm.utexas.edu/lab/howto/cross-linking%20fixatives.pdf

(13)

Kémiai: immobilizáció elektrokémiai polimerizációval

13

• Monomer (pirrol, tiofén) → gyök → polimer

• In situ polimer film elektrokémiai iniciációval

• A vizes oldatban jelenlévő enzimmolekulák bezáródnak a növekvő polimer mátrixba

• Előny:

• Rugalmas módszer, könnyen kontrollálható

• Egyszerűen megvalósítható

• Magas enzimaktivitás

• Akár több réteg is növeszthető, több enzim immobilizálható

• Elektród felületéhez lokalizálódó polimerek: polianilin, polifenolok, polipiridin

(14)

Bioszenzorok általános felépítése

14

Külső membrán pl. dialízis membrán

Jelátalakító (Transzducer) Biológiai érzékelő

(Biokatalizátor)

• Potenciometriás

• Amperometriás

• (Konduktometriás)

• Termikus

• Optikai

• Teljes organizmusok

• Szövetek

• Sejtek

• Organellumok

• Enzimek

• Antitestek S

P

JEL

Jelerősítés

PC

Jel:

pH-változás,

Felszabaduló gáz, Fényemisszió Tömegváltozás Stb.

(15)

Jelátalakító: potenciometriás

Azt a potenciálkülönbséget méri, mely fellép az ion-szelektív membrán két oldalán.

Egy ion-szelektív elektródra mindig érvényes összefüggés:

15 E – mért potenciál

R – egyetemes gázállandó T – abszolút hőmérséklet n – ion töltése

a_i – adott ion aktivitása

• Ionszelektív elektród kalibrációs egyenesének meredeksége standard hőmérsékleten és nyomáson: 59/n mV

• Például:

• karbamid detektálásához ureáz enzim

• Ionszelektív elektród: pH, NH3, CO2

(16)

Jelátalakító: potenciometrikus enzimelektród felépítése

• Mérőelektród: pH-üvegelektród

• Üveggömbre felhordva a gélben rögzített enzim

• Enzimes reakció sztöchiometrikus protonképződéssel vagy NH

₃

felszabadulással jár (segédelektród)

16

(17)

Jelátalakító: amperometriás

Azt az áramot méri, ami az elektródon fellép egy

adott potenciálon. Ez a mért áram egyenes arányban áll a kérdéses anyag oldatbeli koncentrációjával.

Enzimes redox reakció:

Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH2-oxidáz a)Első generációs:

A termék keletkezésének vagy a reakciópartner

fogyásának figyelemmel követésével következtetünk a vizsgálandó anyag koncentrációjára.

Biokatalizátor:

FADH2-oxidáz + O2 → FAD-oxidáz + H2O2

Elektród:

H2O2 → O2 + 2H⁺ + 2e^-

17 Biokatalizátor

http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html

(18)

Jelátalakító: amperometriás

Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH2-oxidáz

• Mi a probléma?

• Oxigén tenziójának helyi ingadozásai (pH, hőmérséklet, ionerősség megváltozása miatt)

• Endogén anyagok nem-specifikus oxidációja miatti hidrogén-peroxid mérés

• Megoldás: mediátorok alkalmazása

18 Biokatalizátor

(19)

Jelátalakító: elektronátadó sók

• Elektronátmenettel járó enzimes reakciók (NAD, FAD mediált reakciók): elektronátadó sók

19

(20)

Jelátalakító: amperometriás

Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH2-oxidáz b) Második generációs:

Mediátorral módosított, a mediátor redox

tulajdonságai segítik az elektrontranszfert az enzim és az elektród felülete között.

Biokatalizátor:

FADH₂-oxidáz + 2 Ferrocénium⁺→ FAD-oxidáz + 2 Ferrocén + 2H⁺

Elektród:

2 Ferrocén → 2 Ferrocénium⁺ + 2e^-

A reakcióban felszabaduló elektronok ferrocén

közvetítésével jutnak az elektródhoz. ²⁰

Biokatalizátor

(21)

Jelátalakító: amperometriás

Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz → Termék + FADH2-oxidáz b) Harmadik generációs:

Direkt enzim-elektród kapcsolat, az elektród

közvetlenül felhasználja a reakcióban felszabaduló elektronokat.

Biokatalizátor/elektród:

FADH2-oxidáz → FAD-oxidáz + 2H⁺ + 2e^-

21 Biokatalizátor

(22)

Jelátalakító: amperometriás – glükóz elektród

Oldott oxigént mérő elektród membránfelületére rögzített glükózoxidáz és kataláz enzim

• Membrán határolja, mely a meghatározandó

szubsztrátra (glükózra), és a termékre (glükonsavra) is áteresztő

• Reakció során csökken a gélben az oldott oxigén koncentrációja, amit az oxigénelektród detektál.

22

(23)

Jelátalakító: termikus

Az enzim által katalizált kémiai reakció hőenergia változását követik (exoterm reakciók, 5-100 kJ/mol)

• A modern termisztorok 0,0001°C különbséget is képesek rögzíteni

Hátránya:

• Nem-specifikus hőhatások miatt a szubsztrát koncentráció túlbecslése (pl. áramlásból adódó).

• A mérőeszköz felmelegedéséből származó hőveszteség.

23

(24)

Jelátalakító: optikai

A biokatalitikus kölcsönhatás során UV-VIS abszorpció, bio- és kemilumineszcencia, fluoreszcencia, foszforeszcencia,

visszaverődés, szóródás, stb. történik.

• Optikai szálak és lézerek fejlődésével nagyobb figyelmet kaptak

• Előnyei az elektrokémiai szenzorokkal szemben:

• Nincs szükség referencia elektródra;

• Nincs szükség közvetlen kapcsolatra a biokatalizátor és az optikai szál között;

• Biztonságosabbak;

• Stabilabbak működési szempontból.

24

(25)

Jelátalakító: optikai

Scheper et al. (1994): BIOOPTROD

Glükóz, fruktóz, glükonolakton és szorbit

• Glükóz-fruktóz oxidáz komplex (Zymomonas mobilis)

• NADP+/NADPH koenzim redukcióját/oxidációját 450 nm-en történő fluoreszcencia detektálásával vizsgálták (gerjesztés 360 nm)

Pl. fruktóz redukálódik szorbittá, NADP+ lesz, fluoreszcencia csökken

25 Az optikai szál egyik végén rögzített szelektív

biokomponens, a szál másik végén gerjesztő és érzékelő egység együttese

(26)

Jelátalakító: optikai

Huang et al. (1991): kemilumineszcencia

• FIA, on-line glükóz, állati sejttenyészet

• Immobilizált glükóz oxidáz (GOD):

Glükóz + O2 + H2O → Glükonsav + H2O2

• Hidrogén-peroxid + luminol → 425 nm-en fényemisszió

26

(27)

Köszönöm a figyelmet!



27