Biofolyamatok mérése

Biofolyamatok mérése

Gazsó Zita Gubicza Krisztina Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat 2014. április 15.

Tartalom

 A mérendő változók csoportosítása

 Mérőeszközök (szenzorok)

 On-line technikák

 Off-line technikák

Változók csoportosítása



modellezés szempontjából



kontrollváltozók



állapotváltozók



a változó természete szerint



fizikai



kémiai



biológiai



mérési módszer szerint:



in situ és ex situ



on-line és off-line

Csoportosítás a modellezés szempontjából

 Valóságos modell kidolgozása bonyolult (transzport- és biokémiai folyamatok)

 matematikai modell

 rendszer és a környezeti változók közötti kapcsolatokat írja le

 általában lineáris az összefüggés

(mért változó – ideális állapotváltozó között)

 kontrollváltozó

 elsődleges hatású

 szoros kapcsolat a rendszerrel,

 feltétlenül szabályozandók

(pH, hőmérséklet, DO, hígítási sebesség, szubsztrátkoncentráció)

 állapotváltozó

 tenyészet válaszai a környezeti behatásokra

(anyagcsere-folyamatok sebessége, enzimek és termékek

Csoportosítás a változók természete szerint

 Fizikai változók: hőmérséklet betáplálási sebesség

folyadékszint viszkozitás habszint nyomás

 Kémiai változók: pH redoxpotenciál oldott O2-szint oldott CO2-szint

 Biológiai változók: szubsztrátkoncentráció sejtszám/sejtkoncentráció

fajlagos növekedési sebesség

Mérési módszer szerint I. A mérés helye

 In situ: a szenzorokat közvetlenül a reaktortérbe építik

- aktuális (nincs időkésés) - ellen kell állnia a sterilezésnek

- folyamatos üzemű mérések - hosszú élettartam szükséges - bonyolult a csere

- szenzor felülete beszennyeződhet

 Ex situ – off-line: mintát veszünk a reaktorból, és a reaktortól függetlenül végezzük a mérést

- költségek - nem „real time”

- hatékonyság- szabályozásra nem jól használható - befertőződés veszélye

 Ex situ – on-line: automatikus mintavétel és mérés

- sterilezhető szenzor- a mért jel nem folytonos - kis időállandó

- hatékony és megbízható mintavevő készülék - minta előkezelése és szenzor kalibrálása

Mérési módszer szerint II.

Globális technikák

a mért változók az egész reaktorra vonatkoznak

pl. integrált fajlagos felület, integrált gáz hold up (integrált = az egész reaktorra összegzett)

Lokális technikák

strukturális modellek igazolásához szükséges paraméterek mérésére

pl. buborékok mérete, fajlagos felületük és sebességük eloszlása

Hőmérséklet

 Növekedés optimuma gyakran nem egyezik meg a termékképzés sebességének optimumával

 másodlagos anyagcseretermékek, pl. antibiotikumok

 diszkrét/folytonos maximum elve

 Pt-100-as ellenállás-hőmérő, ±0,5°C

 az ellenállása garantált  ha az elektromos kapcsolások ellenállása elhanyagolható, kalibráció nélkül

használható

 Fermentáció: 20-40°C, sterilezés: 121-141°C

Nyomás

 Sterilezés, kimenő levegő/gáz-szűrő

 gáz hold up meghatározása

 Membrános nyomásmérő

 steril műveleteknél előnyös

Betáplálási sebesség

 kulcsfontosságú a mérése és szabályozása

 kemosztát bioreaktornál meghatározza a fajlagos növekedési sebességet (hígítási sebesség) és a termelés gyorsaságát (produktivitás)

Habszint

 elsősorban felületaktív fehérjék okozzák, levegőztetett rendszerekben

 veszteséget okoz a fermentléből

 akadályozza a gőztér-analizátorokat

 fertőzésveszélyes

 mérése: reaktor aljában és tetejében elhelyezett két elektród közötti vezetés

 megszüntetése: mechanikusan/habzásgátló adagolásával

Folyadékszint

pH

 Optimum

 Szubsztrát és termék gyakran pH aktív –

szabályozás (nagy pufferkapacitás/sav és lúg adagolása)

 Ellenőrzés

 gyakran a pH változással nyomon kísérhető a termékképződés

 pH váratlan megváltozása – befertőződés

 Mérése

 pH elektród (Ag/AgCl elektród)

 Nernst-egyenlet

 E0: standard potenciál

 F: Faraday-szám

^{E  E}

^{ 2 , 3 RT} _F ^log   ^H

Oldott oxigén

 aerob rendszerekben a biomassza koncentrációjának számítására használják

 OTR (meghatározása oxigénelektróddal)

 OUR, kezdeti sejtkoncentráció, oxigénhozam, maintenance koefficiens aktuális sejtkoncentráció, növekedési sebesség

 K_La mérés (statikus/dinamikus)

 Clark elektród

 katód, anód, elektrolit, oxigénáteresztő membrán

Oldott CO

-szint

 kis kevert tartályreaktoroknál a gáztérben mért értékből határozzák meg (egyensúlyt tart a folyadékfázissal)

 ahol nem áll fenn ilyen egyensúly (toronyreaktorok, nagy kereskedelmi egységek), ott közvetlenül mérik a pCO -t

Biológiai változók

 általában off-line mérések, nagy diverzitás, specifikus mérések

Szubsztrátkoncentráció

 Mintavétel: betáplálást biztosító tartályból, elfolyó léből

 Mérés: kémai reakciókkal, spektrofotométerrel Sejtszám

 Általában off-line szárazanyagtartalom-mérés

(centrifugálás, mosás, szárítás) vagy optikai denzitás mérése (pl. 600nm)

 Kis sejtkoncentráció  Bürker-/Thoma-kamrás sejtszámlálás

 In situ mérési módok

 optikai/elektrokémiai/kalorimetriás/akusztikai/fluorimetriás/szűr éses/anyagmérlegen alapuló technikák

Fajlagos növekedési sebesség

 nem közvetlenül mérik

 a mikrobakoncentráció időbeli növekedéséből számolható

Mérőeszközök (Szenzorok)

 Fizikai elven alapulók

 Optikai szenzorok

 Kalorimetrikus módszer

 Szűrési módszerek

 Kémiai elven alapulók (Kemiszenzorok)

 Elektrokémiai szenzorok

 Tömegnövekedéses szenzorok

 Hőmérsékletszenzorok

 Biológiai elven alapuló szenzorok (Bioszenzorok)

Mérőeszközök – Általános elvárások

 legyen specifikus a célkomponensre

 a kölcsönhatás (sensor-anylate) miatti jelváltozás nagy és érzékeny legyen a vizsgált

koncentrációtartományban

 a szenzor időállandója feleljen meg az időbeni beavatkozásnak

 a fermentáció alatt állandó legyen, mert az

újrakalibrálás nehézkes (főleg on-line vagy in-situ esetben)

 gyakran: sterilezést (autoklávozást) bírja ki

 kis anyag- és energiaigény

 megbízható működés

Fizikai elven alapulók

Optikai szenzorok - Turbidimetria, nefelometria

 szilárd részecskék szuszpenziójának turbiditása

 részecskék koncentrációja, fizikai mérete

 sejtek, szilárd részecskék, légbuborékok

 biotechnológiában általában az áteresztett fényt mérik

 intenzitása a kezdeti fény egy részének szóródása miatt kisebb, mint a megvilágító fényé.

 alacsony biomassza-koncentráció: Lambert-Beer-törvény

 sejtkoncentráció meghatározása

 beérkező fény a szuszpenzió részecskéin szétszóródik

 nefelometria

 90°-os szóródásút szokták mérni

Fizikai elven alapulók

Optikai szenzorok - Turbidimetria, nefelometria

nefelometriás turbidimetriás

küvetta

ablak

I₀ I_tr I_ne

c I l

I_tr





 

0

c lg

I k

I_nef   ₀ 

λ=500-600 nm

Fizikai elven alapulók

Optikai szenzorok - Fluoreszcens

 egy sejttenyészetet megvilágítanak, λ =340- 360nm

 a redukált adenin-dinukleotidok (NADH, NADPH) fluoreszkálnak, λ = 460nm

 Duysens és Amesz

 a fluoreszcencia intenzitásából a biomasszában lévő élő sejtek arányára lehet következtetni

 a biomassza koncentrációja és a fluoreszcencia között linearitás

 Saccharomyces cerevisae

 Streptomyces fajok

 Thermoactinomycet-ák…

Fizikai elven alapulók

Kalorimetrikus módszer



mikrobák tenyésztésekor hő keletkezik



probléma: ahhoz, hogy ezt a kicsi hőt

mérjük, a mikrobákat el kell különíteni a többi hőtermelő folyamattól

 keverés, levegőztetés, betáplálás…



a valódi mérésre használt kalorimetriás mérésekhez a fermentlevet egy külső kaloriméterbe kell vezetni

 a keletkezett hőt monitorizálják

Fizikai elven alapulók Szűrési módszerek

 a sejteket a fermentléből szűréssel el lehet távolítani

 szűrőlepény térfogata  biomassza- koncentráció

 v: fajlagos szűrőlepény-térfogat (l/g)

 V_c: szűrőlepény-térfogat (l)

 Vl: szűrlettérfogat (l)

 Penicillium crysogenumra igazolták

 3 lépés

 Mintavétel

 Mérés

 Szűrővászon tisztítása

c f

c

V V

V v

X l

 



Kémiai elven alapulók (Kemiszenzorok) Elektrokémiai szenzorok

 egy integrált érzékelő réteget és egy

jelátalakítót (transzducert) egyesít úgy, hogy a létrejövő rendszer a célkomponenseket mérni tudja

 ionegyensúly/elektrontranszfer a kémiai szenzor érző rétegén

 a kölcsönhatások kiértékelhetők elektrokémiai jelátalakítóval

 fém elektródok

 három fő típus

 szimmetrikus potenciométer

 aszimmetrikus potenciométer

 amperométer

 potenciometriás műszerek

 a mért feszültség arányos a célkomponens koncentrációjával

 mindig kiegyenlített eszközök

Kémiai elven alapulók (Kemiszenzorok) Elektrokémiai szenzorok

Szimmetrikus potenciométer

ionszelektív elektródként terjedt el

általában két – szelektív membránnal elkülönített – elektrolitot tartalmaz

a potenciált mérik a belső referencia oldat és a minta főtömege között

 kalomel elektród, vagy Ag/AgCl elektród

pH-mérő

 1920-as évek óta kereskedelmi forgalomban Aszimmetrikus potenciométer

nincs belső referenciaoldatuk

az érzőmembrán gyakran csak egy elektrolittal van kapcsolatban

Ion Selective Field EffectTransistor

 ionszelektív membránt tartalmaz, ami egy félvezető felülettel van kapcsolatban

 korlátozott stabilitás

Amperometriás eszközök

adott elektródpotenciálnál a kialakuló áramot mérik

Kémiai elven alapulók (Kemiszenzorok) Tömegnövekedéses szenzorok

 érzőfelületükön a célkomponenssel történő kölcsönhatás miatt tömegnövekedés

 mikromérlegek

 piezoelektromos anyagok (pl.: kvarc)

 hangot generál és vezet

 a kristályok ennek hatására beállnak a rezonanciájuknak megfelelően

 a kristályok felületén keletkező tömeg

megváltoztatja a rezonancia frekvenciáját

 ez a jel arányos az analát koncentrációjával

 páratartalom-mérők

 vékony filmszenzorok

 gázdetektorok

Kémiai elven alapulók (Kemiszenzorok) Hőmérsékletszenzorok



hőelnyelés/hőfejlődés



a hőmérséklet megváltozik



mérése alkalmas analitikai mérésekre



érzékelő csúcs



termoelem (termocouple)



bármely más hőmérséklet-érzékeny eszköz,

pl.: termisztor



gyakran enzim az érzékelő réteg

Kémiai elven alapulók (Kemiszenzorok) Optikai szenzorok

Száloptikás kémiai szenzorok (Fiber Optic Chemical Sensors)

üveg- vagy műanyagszál

tartalmaz egy magot, és egy külső védő tokot

keresztmetszetük 50 μm-1mm

jeltovábbítás a teljes belső visszaverődésen alapszik

egy indikátor festéket kell a magrészhez kötni

pH-mérő

CO₂-mérő

O₂-mérő

On-line steril mintavétel

 sterilezhető, hosszú élettartamú berendezés kell

 on-line monitoring problémáit 75%-ban a rossz mintavétel okozza (Davis, 1990)

 laboratóriumi reaktoroknál nincs holttér, mert túl nagy fermentlé veszteséget okozna

 Appelquist et al. (1989) kémiai sterilezés 5%

formaldehiddel – 8 nap befertőződés nélkül

Off-line mintavevő

Folyamatos/kvázi folyamatos mintavétel

Sejtmentes mintavétel

a dialízis túl lassú, a hígítás túl nagy a monitoringhoz.

Membránokkal

cross-flow membrán modul

(egy fermentlé recirkulációs körbe integrálva)

termelés alatt cserélhető eltömődés megelőzhető

nem használhatók:

- ha a sejtek oxigén-limitre (S. cerevisiae) vagy nyírásra (állati sejtek) érzékenyek

- ha a fermentlé nagyon viszkózus, vagy nagy a szilárd anyag tartalma

On-line technikák

Continuous Flow Analysis (CFA) / Áramló oldatos analitika

levegővel tagolt/tagolatlan

egységei: automatikus mintavevő, perisztaltikus pumpa, analitikai modul, detektor, regisztráló egység

kívánt komponensek meghatározása folyamatos folyadékáramban (vékony csővezeték)

reagensekkel elegyedve jutnak el a detektorhoz

a megfelelő paraméter arányos a meghatározandó

komponens koncentrációjával színintenzitás, fényabszorpció, pH, ionkoncentráció

Flow Injection Analysis (FIA)

 folyamatosan áramló vivőanyag

 minta injektálva, zónát alkotva halad a detektor felé

 reagensekkel kémiai reakció

 keletkező termék valamely fizikai tulajdonságát mérjük

~ folyadékkromatográfia, de itt kicsi a nyomás

CFA, FIA:

 a készülék felépítése, működése állandó

reprodukálható analízis

 hatékonyak - 100-150 analízis/óra

 jól automatizálható

Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC)

 adszorpció – poláris álló fázis, különböző molekulák eltérő adszorpciós készséggel

 fordított fázis – apoláris álló fázis

 ioncsere – álló fázison ionos csoportok, ezzel lép kölcsönhatásba a mintában levő ionos molekula (aminosav, fehérje) fehérjék tisztítása

 ionpár – a mozgó fázisban ionpárt képző

vegyületek, a mintában levő ionokat megkötik, fordított fázisú álló fázis

 gél – eltérő molekulaméret, pórusokba csak adott méretű molekulák férnek be

 affinitás – vizsgálandó molekula specifikus (biokémiai) kötése az állófázishoz

Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC)

 számos komponens vizsgálata egy időben

 könnyen automatizálható

 kis molekulák, fehérjék

 biomolekulák  méretkizárás/ fordított fázis/ ioncsere/

hidrofób kölcsönhatás/affinitás

Fast Protein Liquid Chromatography – FPLC

 Pharmacia fejlesztette ki,

ma elterjedt fehérjemérési módszer

 alapelve ugyanaz, mint a HPLC-nek

 nagy áramlási sebesség, kis töltet szemcseméret

Membránkromatográfia

 sejteket el kell választani a fermentlétől – mikroszűrő membrán

 különböző méretű molekulák elválasztása egymástól – ultraszűrő membrán

 biopolimerek elválasztása kis molekuláktól – dialízis

 mikroszűrő membrán

 kis nyomásesés, nagy áramlási sebesség, de kis specifitás

 kémiailag módosított membránok:

kationos/anionos/affinitás membránok (fehérjék elválasztása, tisztítása, vizsgálata)

Kapilláris elektroforézis

 nagy molekulaméret-tartomány: szervetlen ionok – biopolimerek

 alapja: különböző sebesség elektromos erőtérben

 20-100 cm kapilláris, néhány nl minta

 rövid analízis idő, kis vegyszerigény

 könnyen automatizálható

 nagy elválasztási hatékonyság

 egyszerű on-line detektálás/

elválasztás

Gázkromatográfia (GC)

 töltet szemcséken álló folyadék fázis + mozgó gázfázis

 gyakori detektorok: hővezető képesség mérő, lángionizációs detektor, tömegspektrométer

 on-line ritkán alkalmazzákgőztéranalízis

Tömegspektrometria (MS)

 kijövő gázok analízise (O₂, CO₂)

 gázok és illékony komponensek

 roncsolásmentes

 rövid analízisidő

 lineáris kapcsolat a koncentráció és jel között

Off-line technikák

Sejtméret, életképesség, morfológia

áramlásos citometria – gömb alakú sejteknél

mikroszkópia – nem hatékony

automatizált technikák: mikroszkóp-kép analízis (2D, 3D)

digitalizált mikroszkópkép

életképesség vizsgálata: festékkizárásos tesztek

Fonalas és pelletképző formák morfológiája

szűrésellenállás

mikroszkópos vizsgálat

képanalízis

hifák hossza (fő, mellék, összes), szélessége, hifacsúcsok száma

Intracelluláris komponensek vizsgálata

Áramlásos citometria

különálló sejtek gyors vizsgálata (kb. 10.000 sejt/másodperc)

RNS, DNS, fehérjék, lipidek,

komponensre specifikus fluorofór festés NMR

metabolikus köztitermékek, aminosavak intracelluláris ionok

ATP, ADP, NAD(P)H

roncsolásmentes technika

 alapvető biokémiai utak vizsgálata

Áramló minta vizsgálata

 steril mintavétel, sejtek elválasztása

 intracelluláris fehérjék vizsgálata: CFA/FIA

NADH fluoreszcencia

 360 nm megvilágítás, 460nm-en fluoreszkál

 monitoring, szabályozás (in situ detektálás)

 külső berendezés, így nem kell sterilezni, nincs fertőződési veszély

 érzékeny, azonnali válasz

Köszönjük a figyelmet.

 Hogyan csoportosítjuk a méréséi módszereket azok helye szerint? Mik az egyes módszerek előnyei,

hátrányai?

 Ismertesse a fizikai elven alapuló optikai szenzorok elvi alapjait (nefelometria, turbidimetria)!

 Melyek az elektrokémiai szenzorok fő típusai?

Ismertessen ezek közül egyet!

 Milyen on-line analízis módokat ismerünk, melyiknek mi az előnye és hátránya?

 Milyen on-line mintavevő rendszereket ismerünk?