Bevezetés az UV-Vis-CD- spektroszkópia elméletébe és gyakorlati alkalmazásaiba

Bevezetés az UV-Vis-CD-

spektroszkópia elméletébe és gyakorlati alkalmazásaiba

Fejezetek a fizikai kémiából Ph.D.főtárgy

CSAK KIRÁLIS vegyületek / komplexek vizsgálatára alkalmas!

C

COOH

CH₃ NH₂ H

Centrális királitás Helikális kiralitás

O

OH

OH OH

HO OH

O

OH

OH OH

HO OH

CHO HO H

H OH HO H HO H

CH₂OH

Főbb felhasználási területek (stacionárius mérések)

• Enantiomerek egymástól való megkülönböztetése,

enantiomertisztaság meghatározás.

• Abszolút konfiguráció meghatározás.

• Indukált CD: Két v. több CD-jelet nem adó anyagból olyan komplex jön létre, amely CD-jelet ad.

• Fehérjék, DNS vizsgálata.

A CD (cirkuláris dikroizmus) jelenség

• A síkban polarizált fény két cirkuláris

komponense (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) eltérő MÉRTÉKBEN

nyelődik el, királis mintán áthaladva.

• A_balA_jobb A /c·l (A=A_bal-A_jobb)

 bal_jobb  =190-800nm, e^-

gerjesztés

A síkban polarizált fény két

cirkulárisan polarizált komponense

És a cirkuláris dikroizmus jelensége

Enantiomerek CD-spektruma

 jobb,(R)= _bal,(S), _bal,(R)=_jobb,(S)

_{bal, (R)}-_jobb,(R) = (R) = _{jobb, (S)}-_bal,(S) =  (S)

bal, (S)-jobb,(S)= (S)= jobb, (R)-bal,(R)= (R) TÜKÖRKÉPEK!

-4 -2 0 2 4 6

200 250 300 350 400

[dm3 mol-1 cm-1 ]

Mit mesél a CD-spektrum?

• A molekulában lévő kromofór csoportok egymáshoz képesti térbeli elrendeződéséről, vagyis

a molekula térszerkezetéről ad

információt.

Egy szemléletes modell

(Mi történik az elektronokkal?)

• Optikai aktivitás akkor lép fel, ha az elektron a gerjesztés során helikális pályán mozdul el.

• Királis molekulában csak az egyik irány

lehetséges. Gerjesztéskor VAGY jobbmenetes pályán halad az e^-, VAGY balmenetesen.

• Ezt a két ellentétes irányban cirkulárisan polározott fény NEM AZONOS

MÉRTÉKBEN tudja kiváltani

Egy szemléletes modell

(Mi történik az elektronokkal?)

• Akirális molekula esetén nincs helikális töltés elmozdulás.

• Vagy nincs is jobb és balmenetes pálya, vagy ugyanolyan arányban veszik igénybe mindkettőt.

• MINDEGY, hogy jobbmenetes vagy a balmenetes fény gerjeszt.

Az optikai aktivitás

kvantummechanikai értelmezése

• Helikális pályán való elmozdulás= lineáris elmozdulás+cirkuláris elmozdulás

• Töltés lineáris elmozdulásaelektromos momentum ()

• Töltés cirkuláris elmozdulásamágneses momentum (m)

• Rotátorerősség (a CD-sávok intenzitásával arányos): R=·m=·mcos (,m)

A hexahelicén enantiomerjeinek CD- sáv előjele

 =0° =180°

• cos  =1 cos  = -1

• R = (+) R = (-)

 m

+ CD  m CD

Mi kell a CD jelhez (R-hez)?

• Ott van CD, ahol van abszorpció  kromofór csoport ()

• Kell a molekula kiralitása (m)

• Ennek 3 alapesete:

– Önmagában királis kromofór (nagy intenzitás)

– Akirális kromofórok királisan rögzítve (COUPLET) – Akirális kromofór királis perturbáló környezettel (kis

intenzitás) speciális esete: indukált CD

O O O

O H

(S)

O O

O O

H

N N

NO₂ NO₂

N N

O₂N

NO₂

R N N

H O

O

H H

H H

R

BzO BzO

 BzO BzO

225

- couplet





Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos?]

• Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba.

• Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak.

• Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a

nemkívánt hatásokért felelős

Egy példa (a gyógyszert racémként hozták forgalomba)

• A tájékoztató szerint jól használható köhögés, pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén nyugtatószerként.

Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a

hányingert is csillapítja.

• Célcsoport: állapotos nők.

A Contergan hatóanyagának (thalidomide) antipódjai

• Kiralitás centrum: A piperidilgyűrűn a

H-atom, amely a ftálimid-részhez

Az antipódok hatásai

• (R)-izomer (S)-izomer

teratogén hatású hatékony szedatívum

Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása

• Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R):

bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés, vérnyomásemelkedés, tremor.

• Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító.

• Penicillamin: (R): toxikus, (S): krónikus artritis (izületi gyulladás) ellen –

fájdalomcsillapító, tünetenyhítő.

Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás

• Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság).

• A racém részen felüli túlsúly.

100 100

 

 

 

 

R S

R ee S

S R

S ee R

Abszorpciós és CD-spektrum

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

230 240 250 260 270 280

hullámhossz [nm]

Abszorbancia

R-fea S-fea

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

230 240 250 260 270

hullámhossz [nm]

CD [mdeg]

R-fea S-fea

Enantiomertisztaság meghatározás (koncentráció független)

• Anizotrópia-faktor (g-faktor):

– A CD spektrum intenzitása/az abszorpciós spektrum intenzitása.

– Enantiomerekre egyenlő nagyságú, ellentétes előjelű.







 

 







 

 

l c

l c A

faktor A a

anizotrópi :

Enantiomertisztaság meghatározás

• A g-faktor

– függ az enantiomer összetételtől

– független a

koncentrációtól  nincs bemérési

hiba és hígítási hiba.

-0,0015 -0,001 -0,0005 0 0,0005 0,001 0,0015

230 250 270

g-faktor R-fea

S-fea

Enantiomertisztaság meghatározás

• g-érték vs.

enantiomer összetétel (kalibrációs görbe).

• A mintában nem lehet CD-aktív vagy

abszorbeáló

komponens. ^{0 20 40 60 80 100}

-0,0010 -0,0005 0,0000 0,0005 0,0010

261 nm-en

g-faktor

[(S)-fenilglicinol] [%]

Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei

• (1): CD spektrumok összehasonlítása:

Kérdéses vegyülethasonló, ismert térszerkezetű vegyület.

• (2): Tapasztalati szabály: Adott

elektronátmenetekre megadják a CD-sáv előjelét

• (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és ennek összevetése a mért

Az ismert abszolút konfigurációjú alapvegyületek

O O H

H

(2S,3R)

O O H H

(2R,3S)

A meghatározandók (1)

O O H

H O O

H

H

CH₃

Oktáns szabály

(ketonokra) (2)

• A karbonil-csoport 300 nm körül

észlelhető n→π*

elektronátmenetéhez indukálódó rotátor erősségéhez a

molekula egyes

atomjai koordinátáik szorzatával ellentétes előjelű perturbációs hozzájárulást adnak.

O

x

y

z O

Oktáns-szabály alkalmazása a

vegyületünkre (2)

Kvantumkémiai számítások (3)

•

• A

– Egyeznek  a számítás alapjául szolgáló térszerkezet igazolódott.

– Ellentétesek  a fenti tükörképe az abszolút konfiguráció.

Indukált CD

• Királis gazdamolekula vagy kötőhely (ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely)

• Akirális, kromofór vendégmolekula

(színezékmolekula, hatóanyagmolekula).

• A bekötődő akirális kromofór e-átmeneteit a környezet királisan perturbálja  CD-jel indukálódik.

Indukált CD

• A cisz-parinársav

(akirális, kromofór), a β-laktoglobulinhoz (királis) kötődik.

• 1:1 komplex képződik.

• K megállapítható.

Indukált CD

• Az emberi vér

gyógyszerkötődés

szempontjából fontos fehérje-komponense az AGP.

• Itt 2 db

festékmolekula

kötődik az AGP-hez (couplet).

Indukált CD

• Ciklodextrinek üregébe

gyógyszermolekulát, szinezékanyagot

juttatnak (vízoldható lesz, célba juttatható).

Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata

• CD spektrum alakja

 a vizsgált fehérje másodlagos ill.

harnadlagos szerkezete.

• pH változás,

hődenaturáció, stb...

→ konformációs

Másodlagos szerkezet

• A távoli UV (180nm - 260nm) - amid

kromofórok.

• amid csoportok

egymáshoz képesti

orientációjára jellemző

→ másodlagos szerkezet.

Harmadlagos szerkezet

• A közeli UV (260nm - 320nm) - aromás

oldalláncok.

• azok egymáshoz

képesti orientációjára jellemző →

harmadlagos szerkezet.

Másodlagos szerkezetek arányának meghatározása

• A kívánt fehérje spektrum

kikeveréséhez ezt 4 másodlagos

szerkezetet használják leggyakrabban.

• Legalább 2, de max. 8 féle különböző

komponens

Másodlagos szerkezetek arányának meghatározása

• Az ismeretlen fehérje CD spektruma

= referencia CD spektrumok lineáris kombinációja

• Referencia spektrum: tiszta másodlagos

szerkezetek CD spektruma (szintetikus

polipeptidek). Ma valós fehérjék.

Másodlagos szerkezetek arányát

meghatározó program

A ribonukleáz hődenaturációja

• Jobbra: 0.02% Ribonukleáz A, (0.001M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 °C-on.

• Balra: A CD-jel a hőmérséklet függvényében (222nm-en).

-30 20

-20 -10 0 10

184 200 220 240 250

CD

Wavelength[nm]

-12 -5

-10 -8 -6

10 20 40 60 80

CD

Temperature[C]

Köszönöm a megtisztelő figyelmet!

Remélem mindenki él még…