NO/cGMP-vermittelte Signaltransduktion: Aufklärung der direkten und indirekten Interaktion mit kontraktilen Faktoren innerhalb der Gefäßregulation

Volltext

(1)

NO/cGMP-vermittelte Signaltransduktion:

Aufklärung der direkten und indirekten Interaktion mit kontraktilen Faktoren innerhalb der Gefäßregulation

NO/cGMP signalling:

Identification of direct and indirect interaction with contractile factors in the regulation of the vascular tone

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internatiolnale Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität-Bochum

angefertigt am

Institut für Pharmakologie und Toxikologie

(2)

Referent: Prof. Dr. med. Doris Koesling

(3)
(4)
(5)

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ... V Abkürzungen ... VIII Zusammenfassung ... XI

1 Einleitung... 1

1.1 NO-Synthasen: Isoformen, Regulation und physiologische Effekte ... 1

1.1.1 eNOS KO-Maus ... 3

1.2 Bildung von cGMP durch Guanylyl-Cyclasen ... 3

1.2.1 Membrangebundene Guanylyl-Cyclasen ... 3

1.2.2 NO-sensitive Guanylyl-Cyclasen... 4

1.2.2.1 NO-GC KO-Mäuse ... 5

1.3 Bildung von cAMP durch Adenylyl-Cyclasen... 5

1.4 Abbau von cGMP durch Phosphodiesterasen ... 6

1.5 cGMP-Effektoren ... 8

1.5.1 cGMP-abhängige Proteinkinase... 8

1.5.2 cGMP-regulierte Ionenkanäle... 9

1.6 Aufbau und Funktion der glatten Gefäßmuskulatur ...10

1.7 Regulation des Gefäßtonus ...11

1.7.1 Myosin leichte Ketten Kinase (MLCK) ...11

1.7.2 Rho-Kinase ...11

1.7.3 Myosin leichte Ketten Phosphatase ...11

1.7.4 Molekulare Mechanismen der Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur...12

1.7.5 Molekulare Mechanismen der Relaxation der glatten Muskulatur...14

1.8 Blutdruck ...14

1.8.1 Das Blutgefäßsystem ...14

1.8.2 Regulation des Blutdrucks ...15

2 Zielsetzung ...18

3 Material und Methoden ...19

3.1 Material...19

3.1.1 Chemikalien ...19

3.1.2 Verwendete Mauslinien...19

3.1.3 Verwendete Antikörper...20

(6)

3.2.1 Biochemische Methoden...20

3.2.2 Analytische Methoden...23

3.2.3 Organbadexperimente ...25

3.2.4 Messung des peripheren Gefäßwiderstandes ...27

3.2.5 Behandlung von Mäusen mit kontraktilen Faktoren...28

3.2.6 Behandlung von Mäusen mit Sildenafil ...28

3.2.7 Bestimmung des Noradrenalingehaltes in Plasma und Urin...29

4 Ergebnisse...31

4.1 Morphologische Veränderungen durch die Angiotensin II-Behandlung ...31

4.1.1 Herzhypertrophie ...31

4.1.2 Ang II-induzierte Aortenproliferation ...32

4.1.3 Überlebenskurve...32

4.2 Intrazelluläre cGMP-Spiegel ...34

4.2.1 Intrazelluläre cAMP-Spiegel ...37

4.3 Einfluss der Angiotensin II-Behandlung auf die Mitglieder der NO/cGMP-Signalkaskade ...38

4.3.1 NO-stimulierte GC-Aktivität ...38

4.3.2 cGMP-abbauende Aktivität (PDE-Aktivität) ...38

4.4 Vasorelaxation...41

4.4.1 Endothelabhängige Vasorelaxation...41

4.4.2 NO-vermittelte Vasorelaxation ...43

4.4.3 cAMP-vermittelte Vasorelaxation ...45

4.5 Vasokonstriktion ...47

4.6 Proteinbiochemische Untersuchungen der Vasokonstriktion ...50

4.6.1 Nachweis von aktiv vorliegendem RhoA-GTP ...53

4.7 Blutdruckregulation ...53

4.7.1 Einfluss der Ang II-Behandlung auf die Blutdruckregulation ...54

4.7.2 Einfluss der Ang II- und Sildenafilbehandlung auf die Blutdruckregulation ...54

4.7.3 Einfluss der Noradrenalinbehandlung auf die Blutdruckregulation...56

4.8 Bestimmung der Noradrenalinkonzentration ...57

5 Diskussion ...58

5.1 Angiotensin II induziert eine vaskuläre und eine kardiale Hypertrophie ...58

(7)

5.3 Angiotensin II führt zu einer Abnahme der cGMP-Spiegel ...60

5.3.1 Die cGMP-bildende Aktivität wird durch Angiotensin II nicht beeinflusst...60

5.3.2 Die cGMP-abbauende Aktivität wird durch Angiotensin II erhöht...61

5.4 Eine Reduktion des cGMP-Signals hat eine erhöhte Kontraktilität zur Folge..62

5.5 Verursacht die veränderte Regulation der MLCP die erhöhte Kontraktilität in NO-GC1 KO-Mäusen? ...63

5.6 Ist die Zunahme von aktivem RhoA für die erhöhte Kontraktilität im NO-GC1 KO verantwortlich? ...64

5.7 Ein erhöhter peripherer Gefäßwiderstand führt in die NO-GC1 KO-Mäusen zu keiner Blutdruckerhöhung...65

5.8 Eine reduzierte Sympathikusaktivität kompensiert in den NO-GC1 KO-Mäusen das fehlende NO/cGMP-Signal ...66

5.9 NO-GC1 KO-Mäuse reagieren sensitiver auf die Noradrenalinbehandlung ...67

5.10 Direkte und indirekte Interaktionen kontraktiler Faktoren mit der NO/cGMP-vermittelten Signaltransduktion...68

8 Literatur ...70

9 Eingene Puplikationen ...79

10 Danksagung...80

(8)

Abkürzungen

8-Br-PET-cGMP 8-Bromo-ß-phenyl-1,N²-ethenoguanosine-3',5'-cyclic monophosphate A Adrenalin AC Adenylyl-Cyclase Ach Acethylcholin Ang II Angiotensin II

ANP atrial natriuretic peptide

ATP Adenosin-5'-triphosphat

BCA Bicinchoninsäure (bicinchoninic acid) BNP brain natriuretic peptide

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) CamKII Calmodulin-abhängige Kinase II

cAK cAMP-abhängige Proteinkinase

cGK cGMP-abhängige Proteinkinase

cAMP zyklisches (cyclic) Adenosin 3',5'-monophosphat cGMP Zyklisches (cyclic) Guanosin 3',5'-monophosphat

CaM Calmodulin

CAP-Domäne catabolic activator protein-Domäne

CNG cGMP-regulierte Ionenkanäle (cyclic-nucleotide-gated) CNP c-type natriuretic peptide

d Tag (day)

DAG Diacylglycerol

DEA-NO Diethylamine NONOate

DNA Desoxyribonukleinsäure (Deoxyribonucleic acid)

DTT D,L-Dithiotreitol

EC50 halbmaximale effektive Konzentration

EDFR Endothelium-derived relaxing factor EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure EGTA Ethylenglycoltetraessigsäure eNOS endotheliale NO-Synthase

FAD Flavinadenindinukleotid

FMN Flavinmononukleotid

GAF-Domäne cGMP-Phosphodiesterasen, Adenylyl-Cyclasen, Formatehydrogenlyase

GC Guanylyl-Cyclase

(9)

GEF Guanosinaustauschfaktor (guanine nucleotide exchange factor) GSNO S-Nitroso-L-Glutathion

GTP Guanosin-5'-triphosphoat

HPLC High performance liquid chromatography iNOS induzierbare NO-Synthase

IP3 Ionositol-1,4,5,-Triphosphat

IRAG IP3-Rezeptor assoziierten cGMP-Kinase Substrat

KG Körpergewicht

Km Michaelis-Konstante

KO Knock-out

L-NAME L-NG-Nitroargininemethylester mGC membranständige Guanylyl-Cyclase MLC Myosin leichte Ketten (myosin light chain)

MLCK Myosin leichte Ketten Kinase (myosin light chain kinase) MLCP Myosin leichte Ketten Phosphatase (myosin light chain

phosphatase)

MYPT myosin-phosphatase-targeting

NA Noradrenalin

NAD(P)H Nicotinsäureamidadenindinukleotidhydrogenphosphat nNOS neuronale NO-Synthase

NO-GC NO-sensitive Guanylyl-Cyclase NTS Nucleus tractus solitarii

PDE Phosphodiesterase PE Phenylephrin PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat PKC Proteinkinase C PLC Phospholipase C PMSF Phenylmethansulfonylfluorid RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System RIA Radioimmunoassay RT Raumtemperatur

TAC Transversal aortic banding TBST Tris buffered saline with Tween

TCA Trichloressigsäure

TEA Triethanolamin

Thr Threonin

SER glattes (smooth) endoplasmatisches Retikulum

(10)

SDS Natriumdodecylsulfat

sGC lösliche (soluble) Guanylyl-Cyclase VASP Vasodilator stimuliertes Phosphoprotein Vmax maximale Reaktionsgeschwindigkeit

WT Wildtyp

(11)

Zusammenfassung

Wichtige Gegenspieler bei der Einstellung des Gefäßtonus stellen die relaxierende NO/cGMP-vermittelte Signaltransduktion und die kontraktilen Faktoren, Angiotensin II, der Hauptmetabolit des Renin-Angiotensin-Systems, und das aus sympathischen Nervenendigungen freigesetzte Noradrenalin dar. Die Interaktionen dieser relaxierenden und kontrahierenden Signalwege sollten in dieser Arbeit mit Hilfe von WT und NO-GC1 KO-Mäusen, in denen das Enzym, das hauptsächlich für die NO-stimulierte cGMP-Bildung verantwortlich ist, genetisch ausgeschaltet ist, untersucht werden.

Die direkten Interaktionen dieser Signalwege wurden auf der Ebene des Gefäßtonus mit Hilfe von Organbadexperimenten an isolierten Aortenringen und mit Hilfe des perfundierten Hinterbeines untersucht.

NO-GC1 KO-Mäuse, in denen das cGMP-Signal um 90 % reduziert ist, wiesen eine reduzierte endothelabhängige und NO-vermittelte Vasorelaxation auf, was sich in einer erhöhten Kontraktilität zeigte. Trotz der erhöhten Kontraktilität war die Phosphorylierung der leichten Ketten des Myosins (MLC), was als biochemisches Maß für die Kontraktion angesehen wird, nicht erhöht. In den KO-Mäusen konnte mehr aktives RhoA nachgewiesen werden, was mit Daten von anderen übereinstimmt, dass die cGMP-abhängige Proteinkinase die Aktivierung von RhoA hemmt. Trotz der vermehrten Menge an aktiven RhoA war die Phosphorylierung des Rho-Kinase Substrats, der MLC-Phosphatase, nicht erhöht, sodass im Ganzen, die der Kontraktion zugrunde liegenden molekularen Verhältnisse als verändert darstellen und sich nicht mit den bisherigen Annahmen erklären lassen. Die erhöhte Kontraktilität zeigte sich in den KO-Mäusen auch in einem erhöhten peripheren Gefäßwiderstand, was jedoch nicht zu einer Blutdruckerhöhung führte.

(12)

konnten zwar die cGMP-Spiegel auf das Niveau nicht behandelter Mäuse angehoben werden, diese Erhöhung hatte aber funktionell keine Auswirkung auf die Vasorelaxation, die Kontraktion und den Blutdruck.

(13)

Summary

In the regulation of the vascular tone, the dilatory NO/cGMP pathway is balanced by contractile agonists such as Angiotensin II, the main metabolit of the renin-angiotensin-system (RAS), and Noradrenaline released from sympathetic nerve terminals. To investigate the molecular interplay of these relaxing and contractile pathways, WT and NO-GC1 KO mice, lacking the main cGMP-forming enzyme, were used.

The direct interaction of these pathways was examined on the level of the vascular tone which was assessed in organ bath experiments with isolated aortic rings and in isolated perfused hind limbs.

NO-GC1 KO mice showed a 90 % reduction of the cGMP signal which corresponded with a reduced endothelium-dependent and NO-mediated vasorelaxation paralleled by an increased contractility. Despite the increase in contractility, the phosphorylation of the myosin light chain (MLC), considered as a biochemical indicator for contractility was not increased in the NO-GC1 KO. In the KO the activated form of RhoA (RhoA-GTP) was increased which is in agreement with the finding that the cGMP-dependent protein kinase inhibits the activation of the small GTP-binding protein, RhoA. Despite this increase of activated rho, phosphorylation of the Rho-kinase substrate MLC-phosphatase was not increased. Taken together, the molecular mechanisms underlying contraction appear to be changed compared to WT and can not be explained by the assumptions considered so far to be responsible for the increase in contractile status. Nevertheless, the increased contractility in vessels of the KO mice also caused an increase in peripheral resistance which surprisingly was not accompanied by high blood pressure.

To shift the balance to a more contractile status, KO and WT mice were treated with Ang II for two weeks. The treatment led to a comparable reduction of the endothelium-dependent and -inendothelium-dependent vasorelaxation in WT and KO mice. In addition to the reduced vasorelaxation the Ang II treatment caused an increase in peripheral resistance in the KO without affecting the MLC phosphorylation. The Ang II treatment caused a reduction of intracellular cGMP levels which is compatible with the reduced vasorelaxation. An increase in activity and expression of the PDE1 detected in Ang II treated WT mice most likely is responsible for the reduced cGMP levels. The sildenafil treatment raised cGMP levels without functionally affecting vasorelaxation, contractility and blood pressure.

(14)
(15)

1 Einleitung

Vor mehr als 30 Jahren entdeckten Furchgott und Zawadzki, dass Acetylcholin bei einem unversehrten Endothel zu einer Gefäßrelaxation führt [1]. Sie postulierten einen Faktor, der durch Acetylcholin aus dem Endothel freigesetzt wird und in der glatten Muskulatur eine Relaxation auslöst. Dieser Faktor wurde als "Endothelium-derived relaxingfactor" (EDRF) bezeichnet und später als Stickstoffmonoxid (NO) identifiziert [2, 3]. Für diese Entdeckung erhielten Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro und Ferid Murad im Jahre 1998 den Nobelpreis für Medizin.

Im kardiovaskulären System nimmt die NO/cGMP-vermittelte Signaltransduktion eine essentielle Rolle bei der Gefäßrelaxation ein und wirkt somit regulierend auf den Blutdruck. NO wird im Endothel kontinuierlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gebildet und diffundiert in die benachbarte glatte Muskulatur. Dort aktiviert NO seinen Rezeptor, die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die für die Bildung von cGMP, einem sekundären Botenstoff, verantwortlich ist. Als Gegenspieler bei der Regulation des Gefäßtonus fungieren kontraktile Faktoren wie z.B. Angiotensin II, der wichtigste Metabolit des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems, oder das aus sympathischen Nervenendigungen freigesetzte Noradrenalin. Eine Verschiebung des Gleichgewichtes des Gefäßtonus in Richtung Kontraktion zeigt sich direkt in einer Erhöhung des Blutdrucks und stellt einen Risikofaktor bei der Entstehung einer Hypertonie dar.

1.1 NO-Synthasen: Isoformen, Regulation und physiologische Effekte

Das Signalmolekül NO wird bei der Umsetzung der Aminosäure L-Arginin zu L-Citrullin durch die NO-Synthase (NOS) gebildet. Als Kofaktoren dienen dem Enzym NADPH, Tetrahydrobiopterin, FAD und FMN [4, 5]. Es sind drei Isoformen der NOS bekannt, die endotheliale (eNOS), die neuronale (nNOS) und die induzierbare (iNOS). Bei allen Isoformen handelt es sich um Homodimere, die eine prosthetische Hämgruppe enthalten und sich in ihrer Lokalisation und Regulation unterscheiden [6]. Die iNOS ist für sehr hohe cytotoxische NO-Anstiege in Makrophagen verantwortlich und dient so der unspezifischen Immunabwehr. Sie spielt keine Rolle bei der NO/cGMP-vermittelten Signaltransduktion [7]. Die eNOS und die nNOS werden konstitutiv exprimiert, durch Ca2+/Calmodulin (CaM) aktiviert und leiten die NO/cGMP-vermittelte Signaltransduktion ein.

(16)

an den muskarinergen M3-Rezeptor der Endothelzellen wird Gq/11-Protein vermittelt die Phospholipase C (PLC) aktiviert, die Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (PIP2) zu Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) spaltet. Das lösliche IP3 bindet an den IP3-Rezeptor an der Membran des glatten endoplasmatischen Retikulums (smooth SER) und löst die Freisetzung von Ca2+ aus den intrazellulären Speichern aus [8]. Neben der rezeptorinduzierten Ca2+-Erhöhung, kann diese im Endothel auch durch mechanische Kräfte wie zum Beispiel Scherstress ausgelöst werden. Verantwortlich dafür sind Ca2+-permeable Kationenkanäle, deren Öffnungswahrscheinlichkeit durch die Scherkraft des fließenden Blutes in den Gefäßen erhöht wird [9]. Das Erhöhen der Ca2+-Konzentration führt zu einer Aktivierung der eNOS und somit zur Bildung von NO, das anschließend in die glatte Muskulatur diffundiert und dort zur Synthese von cGMP führt (Abbildung 1).

Abbildung 1: NO/cGMP-Signaltransduktion

In Endothelzellen wird durch mechanische Kräfte oder rezeptorvermittelt die intrazelluläre Ca2+-Konzentration erhöht. Dadurch wird die NOS aktiviert und NO gebildet. NO diffundiert in die glatte Gefäßmuskulatur und aktiviert die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase. Die NO-stimulierte Bildung von cGMP löst über verschiedene Effektoren die nachfolgenden physiologischen Effekte aus.

cGMP Guanylyl-Cyclase Ach Ca 2+ Ca2+/Calmodulin Citrullin + NO L-Arginin NO-Synthase Endothel Scherstress m3 Gq/11 PLC IP3 NO

cGKI PDEs CNG-Kanäle

Physiologische Effekte glatte Muskulatur cGMP Guanylyl-Cyclase Ach Ca 2+ Ca2+/Calmodulin Citrullin + NO L-Arginin NO-Synthase Endothel Scherstress m3 Gq/11 PLC IP3 NO

cGKI PDEs CNG-Kanäle

Physiologische Effekte

(17)

1.1.1 eNOS KO-Maus

Im Jahr 1995 generierten Huang et al. Knockout (KO)-Mäuse, in denen genetisch die eNOS ausgeschaltet wurde. Anhand dieser Mäuse konnte die physiologische Relevanz von NO im kardiovaskulären System untersucht werden. In Organbadversuchen konnte gezeigt werden, dass die Aortenringe der eNOS KO-Mäuse nicht mehr durch Acetylcholin relaxieren. Die Bestimmung der NOS-Enzymaktivität in Aorten von eNOS KO- und WT-Mäusen zeigte eine Reduktion von 12,8 pmol/mg/min auf 0,5 pmol/mg/min. Die geringe Restaktivität wurde auf die nNOS zurück geführt. Dass NO einen Einfluss auf die Blutdruckregulation hat, zeigt sich in einer Blutdruckerhöhung von systolisch etwa 30 mmHg in den eNOS KO-Mäusen. In der Arbeit von Rudic et al. konnte zusätzlich gezeigt werden, dass NO einen negativen Einfluss auf die Proliferation glatter Muskelzellen hat und somit antiproliferativ wirkt [10, 11].

1.2 Bildung von cGMP durch Guanylyl-Cyclasen

Der sekundäre Botenstoff zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) wurde erstmals 1963 in Rattenurin [12] und später in Gewebe von Säugetieren nachgewiesen [13]. Die enzymatische Bildung von cGMP erfolgt durch die Guanylyl-Cyclasen (GC) aus GTP und wurde 1969 erstmals in Säugetiergewebe nachgewiesen [14, 15]. Kimura und Murad konnten in ihrer Arbeit cGMP-bildende Aktivität in der zytosolischen und in der Membranfraktion messen und postulierten, dass verschiedene GCs in der Zelle vorliegen müssen [16]. Bisher wurde die GC-Aktivität in den verschiedensten Zelltypen und Geweben in fast jedem Organismus nachgewiesen [17].

1.2.1 Membrangebundene Guanylyl-Cyclasen

(18)

transportiert. Die Bezeichnung BNP wurde gewählt, da das Peptid erstmals im Gehirn gefunden wurde [21-23]. Für die GC-B wurde als Ligand ein weiteres natriuretisches Peptid identifiziert, hierbei handelt es sich um das in den Endothelzellen gebildete CNP (C-type natriuretic peptide), das als lokal wirkendes Peptid beschrieben wird [24–26]. Als Liganden der GC-C dienen die Peptide Guanylin und Uroguanylin, zusätzlich können an der GC-C hitzestabile Bakterientoxine binden [27–29].

Die Beteiligung der GC-A und GC-B im kardiovaskulären System zeigt sich in den physiologischen Effekten ihrer Liganden. ANP weist starke natriuretische Eigenschaften auf, es steigert die Filtrationsrate, reduziert zusätzlich in den juxtaglomerulären Zellen der Niere die Reninfreisetzung und führt über diese Wege zu einer Senkung des Blutdrucks. BNP, der zweite Ligand der GC-A, wird im Herzen eine antifibrotische Wirkung zugeschrieben. Es führt, wie auch das ANP, zu einer Relaxation der glatten Muskulatur und steigert in der Niere die Filtrationsrate [30, 31]. Die GC-B wird durch CNP aktiviert, das unter anderem in den Endothelzellen und glatten Muskelzellen gebildet wird und auch dort wirkt. Es zeigt einen geringen Einfluss bei der Blutdruckregulation, ihm wird eher ein Einfluss bei der Gefäßbildung zugeschrieben. Es stimuliert das Wachstum von Endothelzellen und wirkt inhibierend auf die Proliferation der glatten Muskelzellen [32].

1.2.2 NO-sensitive Guanylyl-Cyclasen

Bereits Ende der siebziger Jahre wurde gezeigt, dass NO-freisetzende Pharmaka (NO-Donoren) zu einer Erhöhung der cGMP-Konzentration im Gewebe führen [33]. Im Jahr 1981 konnte dann erstmals das Enzym GC aus der Rinderlunge isoliert [34] und später die DNA-Sequenzen einer α1- und einer β1-Untereinheit identifiziert werden [35–38]. Mit Hilfe von Homologievergleichen wurden zwei weitere Untereinheiten identifiziert, die als

α2 und β2 bezeichnet werden [39, 40]. Die β2-Untereinheit konnte nicht auf Proteinebene nachgewiesen werden. Die NO-GC liegt als Heterodimer vor, besteht aus einer α- und einer β1-Untereinheit und besitzt eine prosthetische Hämgruppe an die NO bindet [41, 42]. Die Bindung von NO stimuliert die cGMP-bildende Aktivität bis zu 200fach [43]. Die NO-GCs sind strukturell aus einer C-terminalen katalytischen Domäne, einem zentralen Bereich und einer N-terminalen regulatorischen Domäne, aufgebaut [44]. Der katalytische Bereich ist zwischen den Untereinheiten stark konserviert und weist ebenso Homologien zu dem katalytischen Bereich der mGCs und der Adenylyl-Cyclasen (AC) auf [38].

(19)

Hauptaktivität der NO-stimulierten cGMP-Bildung dar. Die NO-GC2 wurde zu einem großen Anteil im Gehirn und in geringeren Anteilen auch in anderen Geweben gefunden [45]. Der C-terminale Bereich der NO-GC2 weist eine Sequenz auf, die mit den PDZ-Domänen aus Syntrophin sowie dem PSD-95 interagiert, wodurch eine Membranassoziation in der Postsynapse bedingt ist [46].

1.2.2.1 NO-GC KO-Mäuse

Zur genauen Untersuchung der NO-GC Isoformen wurden KO-Mäuse generiert, in denen jeweils eine der beiden α-Untereinheiten oder die β1-Untereinheit genetisch ausgeschaltet ist. Das Ausschalten der β1-Untereinheit führt zur Deletion beider NO-GC Isoformen. Die Lebenserwartung der Mäuse ist reduziert und das Wachstum beeinträchtigt. Die KO-Mäuse weisen einen um etwa 26 mmHg erhöhten systolischen Blutdruck und eine fehlende NO-vermittelte Vasorelaxation der Aorta auf. Ferner haben sie eine gestörte Darmperistaltik aufgrund einer reduzierten gastrointestinalen Motilität. Ernähren sich die NO-GC KO-Mäuse ballaststofffrei erhöht sich ihre Lebenserwartung [47]. Das Ausschalten der α1- oder α2-Untereinheit führt zum Verlust der jeweiligen Isoform, es findet in den KO-Mäusen aber keine Gegenregulation durch die andere Isoform statt. Somit ist die genaue Untersuchung der Funktionen der einzelnen Isoformen in den unterschiedlichen Geweben möglich. Die NO-GC1 und NO-GC2 KO-Mäuse weisen keine verringerte Lebenserwartung und auch keinen äußerlichen Phänotypen auf. Die NO-GC1 Isoform ist z. B. für etwa 90 % der cGMP-Bildung in der Aorta zuständig. In diesen Mäusen scheint die geringe, durch die NO-GC2 gebildete cGMP-Menge auszureichen, um einer hohen Sterblichkeit entgegen zu wirken. Die NO-GC1 KO-Mäuse zeigten in den ersten Untersuchungen einen geringfügig erhöhten systolischen Blutruck (etwa 7 mmHg) und weisen eine reduzierte endothelabhängige Vasorelaxation auf. Die Mäuse, denen die NO-GC2 Isoform fehlt, zeigen erwartungsgemäß keine kardiovaskulären Veränderungen [48] (Abbildung 2).

1.3 Bildung von cAMP durch Adenylyl-Cyclasen

(20)

handelt es sich um membranständige Enzyme, deren Aktivität durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren kontrolliert wird. Sie werden pharmakologisch mit dem Diterpen Forskolin aktiviert und können so die cAMP-Bildung erhöhen [51, 52].

Abbildung 2: Isoformen der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase

Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase liegt in zwei Isoformen in der Zelle vor. Sie unterscheiden sich ausschließlich in ihrer Lokalisation. Durch die Interaktion mit PSD-95 kann die NO-GC2 an der Membran lokalisiert, postsynaptisch nachgewiesen werden. Die Bindung von NO an die prosthetische Hämgruppe führt zu einer 200fachen Aktivierung der cGMP-Bildung.

1.4 Abbau von cGMP durch Phosphodiesterasen

Der Abbau zyklischer Nukleotide wird durch Phosphodiesterasen (PDE) über die Hydrolyse der zyklischen 3’-Phosphatbindung des 3’-5’-cGMP, unter Bildung von GMP, katalysiert. Durch diesen Abbau wird die cGMP-Konzentration in der Zelle reguliert und die NO/cGMP-vermittelte Signaltransduktion beendet. Bisher wurden in Säugetieren 11 PDE-Familien identifiziert, die aus einer C-terminalen, katalytischen Domäne und einer N-terminalen, regulatorischen Domäne zusammengesetzt sind und sich in ihrer Lokalisation innerhalb der Zelle, Regulation und Substratspezifität unterscheiden.

Die PDEs werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Substratspezifität in drei Gruppen eingeteilt: PDEs die hauptsächlich cAMP abbauen (PDE4, 7 und 8), PDEs mit vergleichbarer Spezifität für beide zyklischen Nukloetide (PDE1, 2, 3, 10 und 11) und PDEs, die ausschließlich cGMP abbauen (PDE5, 6 und 9) [53, 54]. Die Regulation der PDEs kann über Phosphorylierungen, Bindung von Ca2+/CaM oder mit Hilfe sogenannte GAF-Domänen erfolgen. Der Name GAF leitet sich von den Anfangsbuchstaben der drei

(21)

Proteine, in denen sie zuerst entdeckt wurden, ab. Hierbei handelt es sich um die cGMP-bindenden Phosphodiesterasen von Säugetiere, die Adenylyl-Cyclasen von Cyanobakterien und den Transkriptionsfaktor Formatehydrogenlyase aus E. coli [55, 56]. GAF-Domänen kommen ausschließlich als Tandem-GAF-Domäne in den PDE-Familien 2, 5, 6, 10 und 11 vor. In den folgenden Abschnitten sollen die PDEs der Familien 1, 3 und 5, die unter anderem im kardiovaskulären System eine wichtige Rolle spielen, im ausführlich beschrieben werden.

Die PDE1 wird von drei verschiedenen Genen codiert (PDE1A, 1B und 1C), die Isoformen unterscheiden sich in ihrer Regulation und Lokalisation. PDE1A wird in Aorta, Lunge, Herz und Hoden [57], PDE1B hauptsächlich im Gehirn [58] und PDE1C im olfaktorischen Epithel und proliferierenden glatten Muskelzellen exprimiert [59, 60]. Die Isoformen der PDE1 werden durch die Bindung von Ca2+/CaM und über eine Phosphorylierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (cAK) reguliert, die die Affinität der PDE1 gegenüber Ca2+/CaM verringert und somit hemmend wirkt [61, 62]. Die Isoformen zeigen unterschiedliche Affinitäten für beide zyklischen Nukleotide. PDE1C hydrolysiert beide zyklischen Nukleotide gleichermaßen, hingegen weisen die PDE1A und PDE1B eine höhere Affinität für cGMP auf. Als Hemmstoff der PDE1 wurde Vinpocetin identifiziert, allerdings kommt es erst bei hohen Konzentrationen zu einer Hemmung, womit Vinpocetin nicht als idealer Hemmstoff gilt. Kommerziell ist kein anderer Inhibitor für die PDE1 erhältlich [63].

Zu der Familie der PDE3 zählen zwei Isoformen, (PDE3A und 3B) sie bauen cGMP und cAMP gleichermaßen ab, die Vmax ist für cAMP aber zehnfach höher. Bei hohen cGMP-Konzentrationen wird die PDE3 inhibiert, und demnach auch als cGMP-inhibierte cAMP-abbauende PDE beschrieben. Eine weitere Regulation der PDE3 erfolgt über eine Phosphorylierung durch die cAMP-abhängige Proteinkinase, die der Aktivierung des Enzyms dient und den vermehrten Abbau von cAMP zur Folge hat. Bei diesem Mechanismus handelt es sich um eine negative Rückkopplung [64–66]. Die PDE3 wird im Herzmuskel exprimiert und begrenzt dort die cAMP-vermittelte Kontraktion. Sie wird auch im Fettgewebe, in der glatten Muskulatur, in der Leber und in Thrombozyten exprimiert [53]. Die PDE3 wird spezifisch mit dem Inhibitor Milrinon gehemmt, der auch therapeutisch für die Behandlung von akuter Herzinsuffizienz eingesetzt wird [67].

(22)

negative Rückkopplung und somit wichtig für die Regulation der cGMP-Konzentration in der Zelle. Die PDE5 ist bei der Thrombozytenaggregationshemmung und der Relaxation der glatten Muskulatur eingeschaltet, weiter wird die PDE5 in Lunge, Herz, Gehirn und Corpus cavernosum exprimiert [70, 71]. Bei der Suche nach einem spezifischen Inhibitor der PDE5 erhoffte man sich eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Spiegel und so eine Relaxation der glatten Muskulatur der Herzkranzgefäße. Es wurden die PDE5 Hemmer Silenafil (Viagra®), Taldanafil und Vardenafil entwickelt, die heute hauptsächlich zur Behandlung der erektilen Dysfunktion eingesetzt werden. Die Substanzen verstärken im Corpus cavernosum die NO/cGMP-vermittelte Gefäßrelaxation [72, 73]. Seit 2006 wird Sildenafil (Revatio®) auch zur Behandlung der pulmonalen Hypertonie eingesetzt [74]

1.5 cGMP-Effektoren

Zu den Effektoren des cGMPs zählen die cGMP-abhängigen Proteinkinasen und die cGMP-regulierten Ionenkanäle. Diese genannten Enzyme werden durch die intrazelluläre cGMP-Konzentration beeinflusst und lösen wichtige physiologische Prozesse aus. Zu den cGMP-Effektoren werden ebenso die PDEs gezählt, die GAF-Domänen besitzen, an die das cGMP bindet und die PDEs in ihrer Aktivität beeinflussen. Wie oben beschrieben, zählen zu den cGMP-Effektoren die PDEs der Familien 2, 5, 6, 10 und 11.

1.5.1 cGMP-abhängige Proteinkinase

Die cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cGK) stellen im kardiovaskulären System den wichtigsten Effektor des cGMPs dar. Die cGKs liegen als Homodimere vor, zählen zu den Serin/Threonin-Kinasen und werden durch die Bindung von cGMP aktiviert [75]. Bisher konnten in Säugetieren zwei Familien identifiziert werden, die als cGKI [76] und cGKII bezeichnet werden [77]. Von der cGKI existieren zwei Isoformen, die sich in den ersten 89 bzw. 104 Aminosäuren unterscheiden und die als cGKIα und cGKIβ bezeichnet werden [78]. Die cGKI liegt löslich in der Zelle vor, die cGKII hingegen ist, über eine N-Myristoylierung, membranassoziiert [79].

(23)

Pseudosubstratsequenz von neun Aminosäuren. Der hemmende Einfluss der Pseudosubstratsequenz wird durch die Bindung von cGMP aufgehoben. In ihrer Nähe kann es zusätzlich zu einer Autophosphorylierung kommen, wodurch die Affinität gegenüber cGMP erhöht wird [81-83].

Die cGKIα wird hauptsächlich im Herzen, der Lunge und im Gehirn exprimiert. In der

glatten Muskulatur kommen beide Isoformen der cGKI gleichermaßen vor. Die cGKIβwird vorwiegend in Thrombozyten, im Hippocampus und olfaktorischen Neuronen exprimiert [84]. Die cGKI phosphoryliert Ca2+-abhängige Kaliumkanäle (BACa-Kanäle [85]), den IP3-Rezeptor und das IP3-Rezeptor assoziierte cGMP-Kinase Substrat (IRAG). Die beiden zuletzt genannten Substrate sind für die Regulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration notwendig. Die Phosphorylierung von IRAG wird durch die cGKIβ katalysiert und hemmt die IP3-stimulierte Ca2+-Freisetzung aus dem sakroplasmatischen Retikulum [86]. Ein wichtiges Substrat der cGKIα in der glatten Muskulatur ist die regulatorische myosin-phosphatase-targeting-Untereinheit (MYPT) der Myosin leichte Ketten Phosphatase (MLCP). Diese Phosphorylierung führt zu einer Aktivierung der MLCP und somit zu einer Relaxation der glatten Muskulatur [87]. Eines der am besten untersuchten Substrate der cGKI ist das Vasodilator stimulierte Phosphoprotein (VASP), es weist drei Phosphorylierungsstellen auf, die von der cGKI aber auch von der cAK phosphoryliert werden [88, 89]. Die Phosphorylierung von VASP soll zum einen Einfluss auf die Regulation der Aktinfilamentassemblierung und Aktinpolymerisierung [90], und zum anderen auf die Inhibition der Thrombozytenaggregation, haben [91].

1.5.2 cGMP-regulierte Ionenkanäle

(24)

1.6 Aufbau und Funktion der glatten Gefäßmuskulatur

(25)

1.7 Regulation des Gefäßtonus

Der Gefäßtonus ergibt sich aus der Balance zwischen Kontraktion und Relaxation. Findet eine Reduktion der Relaxation statt, drückt sich dieser Zustand in einer erhöhten Kontraktilität aus. Deshalb nimmt die NO/cGMP-vermittelte Signaltransduktion eine wichtige Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus ein. Die an der Regulation des Gefäßtonus beteiligten Enzyme sollen im Folgenden im Detail beschrieben werden.

1.7.1 Myosin leichte Ketten Kinase (MLCK)

Die MLCK katalysiert die Phosphorylierung der MLC und ist für die Regulation des Gefäßtonus wichtig. Die MLCK ist in drei Domänen aufgeteilt, eine N-terminale Domäne, die eine Aktinbindestelle enthält, eine katalytische Domäne, die die Bindestellen für Mg2+, ATP und die MLC beinhaltet und eine C-terminale Domäne, die die Ca2+/CaM-Bindestelle enthält [104]. Die MLCK wird durch die Bindung von Ca2+/CaM aktiviert. Als ein weiterer regulatorischer Schritt wird die MLCK durch eine Phosphorylierung in der Nähe der Ca2+/CaM-Bindestelle, die die Affinität gegenüber Ca2+/CaM verringert, in ihrer Aktivität gehemmt. Es werden drei Kinasen als mögliche Kandidaten dieser Phosphorylierung genannt, die cAK, die PKC und die Ca2+/CaM-abhängige Kinase II (CaMKII).

1.7.2 Rho-Kinase

Die Rho-Kinase ist der Effektor der kleinen Rho-GTPase RhoA. Die Rho-Kinase wird ubiquitär exprimiert und unterteilt sich in eine Serin/Threonin-Kinasedomäne am N-Terminus und einen Membrananker im C-Terminus. In ihrem inaktiven Zustand liegt sie zytosolisch vor. Wenn sie aktiviert wird, transloziert sie an die Membran [105]. Die Aktivierung der Rho-Kinase erfolgt G-Protein vermittelt (G12/13, und Gq/11), über einen Austausch von GDP zu GTP mit Hilfe des sogenannten Guaninnukleotidaustauschfaktors (engl.: guanin nukleotid exchange factor GEF), unter Bildung der aktiven Form RhoA-GTP. Die Rho-Kinase ist unter anderem für die Phosphorylierung der MLCP verantwortlich, die damit in ihrer Aktivität gehemmt wird, wodurch eine Kontraktion begünstigt wird [106, 107].

1.7.3 Myosin leichte Ketten Phosphatase

(26)

eine katalytische Untereinheit, eine Serin/Threonin-Phosphatase der PP1 Phosphatasen, eine regulatorische Myosinbinde-Domäne (MYPT1) und eine 20 kDa großen Untereinheit, von der die Funktion bisher noch nicht geklärt wurde [108, 109]. Die MYPT-Untereinheit weist eine Leuzin-Zipper Region auf, an der die cGKIα binden kann. Die MLCP ist an den Myosinfasern verankert, eine Aktivierung der Phosphatase hat eine Konformationsänderung zu Folge. Die MLCs gelangen so in die Nähe der katalytischen Domäne [110]. Die MLCP wird über verschiedene Phosphorylierungen reguliert. Diese Phosphorylierungsstellen werden im Folgenden für das murine Ortholog beschrieben. Für die Inhibition der MLCP-Aktivität ist in der glatten Muskulatur hauptsächlich die Rho-Kinase verantwortlich. Die Phosphorylierung an Thr694 wird in der Literatur als die wichtigste inhibierende Stelle beschrieben [107]. Des Weiteren phosphoryliert die Rho-Kinase die Stelle Thr852. Diese Phosphorylierung führt zu einer Reduktion der Bindungsaffinität gegenüber MLC, was die Kontraktilität erhöht [111]. Die einzige aktivierende Phosphorylierung der MLCP ist an Ser693 beschrieben, die durch die cGK und die cAK phosphoryliert wird. Die Phosphorylierung soll keinen direkten Einfluss auf die Aktivität haben, sondern die Phosphorylierung an Thr694 verhindern, was eine Relaxation fördert [112]. Der genaue Mechanismus und die Reihenfolge bzw. Priorität der Phosphorylierungsstellen innerhalb der MYPT-Untereinheit sind bisher noch nicht abschließend geklärt.

1.7.4 Molekulare Mechanismen der Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur

(27)

Abbildung 3: Regulation des Gefäßtonus

Der Gefäßtonus ergibt sich aus der Balance dilatorischer und konstriktorischer Einflüsse. Er ist maßgeblich von der Phosphorylierung der MLC abhängig. Die Relaxation wird durch die Bildung von cGMP oder cAMP ausgelöst. Durch die Effektoren der sekundären Botenstoffe werden die Aktivitäten der MLCK und MLCP kontrolliert. Als Gegenspieler zu der NO/cGMP-Signaltransduktion stehen die kontraktilen Faktoren, die über Ca2+ -abhängige und Ca2+-unabhängige Wege zu einer Kontraktion führen können.

Gq/11 G

12/13

Ang II/NA Ang II

Ca2+- Kanal PLC IP3 SER IRAG IP3-R Ca2+ Ca2+ pMLC MLC MLC-Phosphatase RhoGEF RhoA Rho-Kinase MLC-Kinase Gs Forskolin Ca2+ NO NO-GC cGMP cGKIβ cAMP AC NO NO-GC cGMP cGKIαααα RELAXATION KONTRAKTION PSer693 P Thr694 PThr852 P cAK PDE PDE PDE konstriktorische Substanzen dilatorische Substanzen Gq/11 G 12/13

Ang II/NA Ang II

(28)

1.7.5 Molekulare Mechanismen der Relaxation der glatten Muskulatur

Durch die sekundären Botenstoffe cGMP und cAMP, wird die Relaxation der glatten Muskulatur über eine Erniedrigung der intrazellulären Ca2+-Konzentration vermittelt. Die Reduktion der Ca2+-Konzentration hemmt die MLCK in ihrer Aktivität und die Relaxation kann stattfinden [118].

Die Relaxation wird über drei wichtige Phosphorylierungen vermitteltet. Die cGKI geht mit der MYPT-Untereinheit der MLCP eine Interaktion ein und phosphoryliert diese. Die Phosphorylierung geht mit einer erhöhten Dephosphorylierung der MLC einher [87]. Die beiden anderen cGKI-vermittelten Phosphorylierungen sorgen für eine Reduktion der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Eine Phosphorylierung von IRAG bewirkt eine reduzierte IP3-Rezeptor Öffnungswahrscheinlichkeit und somit eine reduzierte Ca2+-Freisetzung in den intrazellulären Raum [86]. Eine Phosphorylierung der BKCa-Kanäle führt zur Senkung des Membranpotentials und so zu einer Abnahme der Öffnungswahrscheinlichkeit der spannungskontrollierten L-Typ Ca2+-Kanäle [85] (Abbildung 3).

1.8 Blutdruck

1.8.1 Das Blutgefäßsystem

(29)

1.8.2 Regulation des Blutdrucks

Die Blutdruckregulation hängt von verschiedenen Faktoren ab. Hierbei spielt der Gefäßtonus eine wichtige Rolle, der aus einem Zusammenspiel zwischen Relaxation und Kontraktion resultiert. Änderungen im Gefäßtonus spiegeln sich in Änderungen der Blutdruckregulation wieder. Neben dem Gefäßtonus haben Veränderungen im Stoffwechsel, im Herz-Zeit-Volumen und äußere Einflüsse einen Effekt auf die Blutdruckregulation. Die Anpassung des Blutdrucks an diese Veränderungen werden neurogen (über die vegetativen Nerven), endokrin (über zirkulierende Hormone), parakrin (mit Hilfe von lokal gebildeten Wirkstoffen) und myogen (durch die Muskulatur bedingt) reguliert. Gefäße besitzen einen myogenen Basaltonus, der durch den im Gefäß herrschenden Druck reguliert wird. Dieser Effekt wird auch als Bayliss-Effekt beschrieben und kommt vor allem in Widerstandsgefäßen vor. Die Dehnung der Gefäße sorgt für eine Öffnung von mechanosensitiven Kaliumkanälen, es folgt eine Depolarisation der Zelle und ein Einstrom von Ca2+. Die Erhöhung der Ca2+-Konzentration in der glatten Muskulatur führt zu einer Kontraktion [121].

Die neuronale Steuerung des Gefäßtonus erfolgt über den Sympathikus. Die sympathischen Fasern verlaufen an der Grenze zwischen Adventitia und Tunica media. Noradrenalin (NA) wird aus den terminalen Varikositäten freigesetzt und sorgt in der glatten Muskulatur über α1-Rezeptoren, die Gq/11-gekoppelt sind, für eine Kontraktion. Bei einer vermehrten Ausschüttung, kann NA über α2-Rezeptoren, seine eigene Freisetzung hemmen. Die neuronale Steuerung findet hauptsächlich in den kleinen Widerstandsgefäßen und nur im geringen Maße in der Aorta statt [122].

Die endokrine und parakrine Steuerung des Blutdrucks erfolgt über Hormone, die im Blut zirkulieren und so eine systemische Wirkung haben. Adrenalin wird bei starker sympathischer Erregung im Nebennierenmark gebildet und zusammen mit einer geringen Menge an NA, in einem Verhältnis von 4:1, freigesetzt. Adrenalin hat eine hohe Affinität zu β-adrenergen Rezeptoren, kann aber bei hohen Konzentrationen auch an

α-adrenergen Rezeptoren binden. Adrenalin führt im Herzen über die β1-Rezeptoren, zu einer Erhöhung der Herzfrequenz und Zunahme der Kontraktionskraft. In den Bronchien und den Gefäßen der Skelettmuskulatur führt Adrenalin über die β2-Rezeptoren zu einer

(30)

Muskulatur über Gq/11- oder G12/13-gekoppelte Rezeptoren, zu einer Kontraktion. Zum anderen bindet Ang II an präsynaptische AT1-Rezeptoren und stimuliert die Freisetzung von A/NA im Nebennierenmark und vegetativen Neuronen [125, 126]. Die Freisetzung von A/NA führt zu den bereits genannten Effekten und so zu einer Blutdruckerhöhung. Ein weiterer endokriner Faktor ist das ANP. Es wird bei erhöhten zentralvenösen Drücken in Abhängigkeit der Wandspannung, von den Vorhofmyozyten freigesetzt und bewirkt in der glatten Muskulatur durch Bindung an die mGC und der nachfolgenden cGMP-Bildung, eine Relaxation. Als ein weiterer blutdrucksenkender Faktor gilt das NO. Das Gefäßendothel setzt kontinuierlich NO frei, dass wie oben beschrieben eine Auswirkung auf die Blutdruckregulation hat. Bereits im Jahr 1989 konnten Rees et al. zeigten, dass eine Behandlung von Kaninchen mit dem Inhibitor der NOS (L-NMMA) konzentrationsabhängig zu einer Erhöhung des Blutdrucks führt, was die Relevanz der NO/cGMP-Signaltransduktion bei der Blutdruckregulation zeigt [127] (Abbildung 4).

1.8.3 Baroreflex

Der Blutdruck ist der herrschende Druck in einem Blutgefäß, der sich aus verschiedenen Parametern zusammensetzt. Er lässt sich nach folgender Formel berechnen:

Blutdruck (P)= Herzzeitvolumen (Q) x Gefäßwiderstand (R)

Das Herzzeitvolumen wird wie folgt beschrieben:

Herzzeitvolumen (Q)= Herzschlagvolumen (SV) x Herzfrequenz (HF)

Bei kurzfristigen Veränderungen des Blutdrucks wird der Baroreflex aktiviert und versucht den Blutdruck aufrecht zu erhalten. Die Barorezeptoren befinden sich vor allem am Aortenbogen und am Carotissinus, dort ragen ihre Nervenendigungen bis in die Tunica media und intima. Eine Dehnung der Gefäßwand, aufgrund einer Änderung des peripheren Gefäßwiderstands, aktiviert mechanosensitive Na+-Kanäle und hat eine Depolarisation zur Folge. Der Reiz wird über sensorische Afferenzen an den Nucleus tractus soltarii (NTS) der Medulla oblongata weitergeleitet und dort verschaltet. Bei einem Blutdruckabfall werden über den Baroreflex sympathischen Efferenzen zum Herzen aktiviert, was eine Erhöhung der Herzfrequenz zur Folge hat [128].

(31)

Abbildung 4: Physiologische Angriffspunkte kontraktiler Faktoren innerhalb der Blutdruckregulation

Eine vermehrte Freisetzung von NA und/oder Ang II aus der Nebenniere hat eine Blutdruckerhöhung zur Folge. Ang II und NA können direkt eine Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur auslösen, die zu einer Erhöhung des peripheren Gefäßwiderstands führt. Barorezeptoren nehmen diese Druckänderung wahr und leiten sie an den NTS der Medulla oblongata weiter. Durch den Baroreflex wird der Sympathikus zentral so eingestellt um über eine Reduktion der Herzfrequenz den Blutdruck aufrecht zu erhalten. Ang II: Angiotensin II, HF: Herzfrequenz, NA: Noradrenalin, NN: Nebenniere, NTS Nucleus tractus solitarii

(32)

2 Zielsetzung

Die NO/cGMP-vermittelte Signaltransduktion spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus. Die zentrale Rolle innerhalb dieser Kaskade nehmen die NO-sensitiven Guanylyl-Cyclasen (NO-GCs) ein, die durch NO aktiviert werden und über eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration zu einer Vasorelaxation führen. Die Hauptisoform der NO-GC im kardiovaskulären System ist die NO-GC1, die in der Aorta für 90 % der cGMP-Bildung verantwortlich ist. Bei der Gefäßregulation stehen dem dilatorischen NO/cGMP das konstriktiorische Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) und das, aus sympathischen Nervenendigungen freigesetzte Noradrenalin, gegenüber.

In dieser Arbeit sollten direkte Interaktionen auf den Gefäßtonus und indirekte Interaktionen den Blutdruck betreffend, der NO/cGMP-vermittelten Signaltransduktion mit kontraktilen Faktoren untersucht werden. Die Interaktionen sollten, in Mäusen mit unterschiedlicher cGMP-Bildung, mit Hilfe biochemischer und physiologischer Methoden untersucht werden, um Veränderungen in der Aktivität der beteiligten Signalkaskaden zu erfassen und deren physiologischen Auswirkungen auf die Gefäß- und Blutdruckregulation aufzuklären.

Zur Aufklärung der Interaktionen sollten folgende Mausmodelle bzw. Behandlungen eingesetzt werden:

1. NO-GC1 KO-Mäuse, die eine reduzierte cGMP-Bildung und somit ein Ungleichgewicht bei der Einstellung des Gefäßtonus aufweisen.

2. Angiotensin II- bzw. Noradrenalin-Behandlung der WT- und NO-GC1 KO-Mäuse, um eine Verschiebung des Gleichgewichtes des Gefäßtonus zu erzeugen.

3. Sildenafilbehandlung der Angiotensin II-behandelten WT- und NO-GC1 KO-Mäuse, um über eine Erhöhung der cGMP-Spiegel, eine Normalisierung des Gefäßtonus zu erzielen.

(33)

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien

Tabelle 1: Verwendete Substanzen

Verwendete Substanzen Hersteller

8-Br-PET-cGMP Biolog (Bremen)

Angiotensin II human Sigma (Taufkirchen)

Calyculin A R&D Systems (Wiesbaden-Nordenstadt)

Carbachol Sigma (Taufkirchen)

DEA-NO Enzo Lifescience (Lörrach)

Diclofenac Sigma (Taufkirchen)

Forskolin Sigma (Taufkirchen)

GSNO Enzo Lifescience (Lörrach)

Heparin Sigma (Taufkirchen)

L-NAME Enzo Lifescience (Lörrach)

Noradrenalin Sigma (Taufkirchen) Phenylephrin Sigma (Taufkirchen)

Viagra Pfizer (New York, USA)

Vinpocetin R&D Systems (Wiesbaden-Nordenstadt)

Alle weiteren Chemikalien wurden von den Firmen Applichem (Darmstadt), Chromsystem (München), Fluka (Buchs, CH), GE Healthcare (Uppsala, SW), J.T. Baker (Deventer, NL), Merck (Darmstadt), Recipe (München), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), Sigma (Taufkirchen), Bio-Rad (München) und Thermo Fisher (Bremen) bezogen und lagen in Analysequalität vor.

3.1.2 Verwendete Mauslinien

(34)

3.1.3 Verwendete Antikörper

Tabelle 2: Verwendete primäre Antikörper

Antigen Wirt Verdünnung Hersteller

α αα

α1-UE der NO-GC1 Kaninchen 1:10.000 PSL (Heidelberg)

MLC Kaninchen 1:1.000 Santa Cruz (Heidelberg)

PDE1A Ziege 1:500 Santa Cruz (Heidelberg) PDE5 Kaninchen 1:1.000 NEB (Frankfurt)

Tabelle 3: verwendete sekundäre Antikörper

Antigen Wirt Verdünnung Hersteller

Kaninchen Ziege 1:2.500 Sigma (Taufkirchen) Ziege Kaninchen 1:2.500 Sigma (Taufkirchen)

3.2 Methoden

3.2.1 Biochemische Methoden

3.2.1.1 Herstellung von Aortenhomogenaten

Für die Entnahme der Aorta wurden die Mäuse durch CO2-Inhalation betäubt und anschließend dekapitiert. Die entnommene Aorta wurde gewogen und vom umliegenden Gewebe befreit. Zu der Aorta wurden 300 µl eines Homogenisierungspuffers (50 mM TEA/HCl, 50 mM NaCl, 2 mM DTT, 200 µM Benzamidin, 400 µM PMFS, 200 µM Pepstatin A, pH 7,4) gegeben und mit Hilfe eines eiskalten Glas-Glas-Homogenisators homogenisiert. Für die Aktivitätsmessungen wurde das Homogenat verwendet, für die Westernblotanalysen wurde das Homogenat sedimentiert (10 min, 800x g, 4 °C) und das geklärte Lysat verwendet.

3.2.1.2 Proteinkonzentrationsbestimmung, Gelelektrophorese und Westernblot

(35)

(Low/High Molecular Weight Calibration Kit, GE Healthcare), die parallel zu den Homogenaten auf den entsprechenden Gelen aufgetragen wurden. Die Gelelektrophorese wurde in Mini-Gelkammern (Mini-Protean II Cell, Bio-Rad) für 80 min bei 160 V und 27 mA pro Gel mit einem Laufpuffer (0,1 % (w/v) SDS, 75 mM TRIS/HCl und 192 mM Glycin, pH 8,3) durchgeführt. Der Westernblot erfolgte nach der Methode von Towbin [133]. Die in dem SDS-Polyacrylamidgel fokussierten Proteine wurden auf eine Nitrocellulosemembran (Protan-Membran, Whatman) transferiert. Der Transfer erfolgte unter Kühlung in den mit Transferpuffer (0,02 % (w/v) SDS, 25 mM TRIS/HCl, 20 % (v/v) Methanol, pH 8,3) gefüllten Apparaturen (Mini-Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell, Bio-Rad). Die Dauer betrug eine Stunde bei 180 V und 250 mA. Zur Überprüfung des Proteintransfers wurde die Membran mit Ponceau S-Reagenz (0,25 % (w/v) Ponceau S, 10 % (v/v) TCA) gefärbt. Nachdem die Membran entfärbt wurde, folgte die Blockierung mit einer 1:10 verdünnten Roti-Block-Lösung (Roth) für 30 min. Die Inkubation mit einem in Ovalbumin (3 % (w/v) in TBST (150 mM NaCl, 10 mM TRIS/HCl, 0,1 % (v/v) Tween20, pH 8,0)) verdünnten Primärantikörper erfolgte bei Raumtemperatur für eine Stunde oder ü.N. bei 4 °C. Anschließend folgte die Inkubation m it einem Meerrettich-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörper für eine Stunde bei RT. Als Substrat wurde das „Super Signal West Dura Extended Duration Substrate“ (Thermo Scientific) verwendet. Die Chemilumineszenz wurde mit einer 16-bit CCD-Kamera in einer lichtisolierten Kammer (BiochemiTM GDS 8000 System, UVP) detektiert.

3.2.1.3 Charakterisierung von Antikörpern

(36)

erfolgte wie unter 3.2.1.2 beschrieben. Tabelle 5 sind die Antiseren und die in dieser Arbeit verwendeten Verdünnungen zu entnehmen.

Tabelle 4: Für die Herstellung der Antikörper verwendete Peptidsequenzen

Antikörper Peptidsequenz

MYPT CKLYEQILAENE

pMYPT Thr852 CKRRSXGVSF (x=phospho Threonin) pMYPT Ser693 CQSRRXTQGV (x=phospho Serin)

pMLC Ser20 CPQRATXNVF (x=phospho Serin)

´

Abbildung 5: Charakterisierung der MYPT- und MLC-Antikörper

A) Charakterisierung der Antikörper gegen die regulierenden Phosphorylierunsstellen der MYPT-Untereinheit der MLCP (hergestellte Positiv (+)- und Negativ (-)-Kontrollen). B) Charakterisierung der Antikörper gegen phosphospezifischen Antikörper gegen die MLC (hergestellte Positiv (+)- und Negativ (-)-Kontrollen).

Tabelle 5: Verwendete Antiseren

Antikörper Verwendete Antiseren

MYPT Tier 2, Endblutung 1:1.000

pMYPT Thr852 Tier 1, Endblutung 1:1.000 pMYPT Ser693 Tier 2, Endblutung 1:1.000 pMLC Ser20 Tier 2, Erste Blutung 1:1.000

3.2.1.4 Nachweis von aktivem RhoA-GTP

Der Nachweis von aktivem RhoA-GTP erfolgte mit Hilfe eines erworbenen Tests der Firma Thermo Fisher (Bremen). Dieser Test wurde abweichend der Herstellerangaben mit ganzen Aorten durchgeführt. Die Aorten wurden präpariert und in 500 µl Lysepuffer mit

(37)

einem Glas-Glas-Homogenisator homogenisiert. Die weitere Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.

3.2.2 Analytische Methoden

3.2.2.1 Herstellung von radioaktiv markiertem zyklischen Adenosin-/ Guanosinmonophosphat (Tracer)

Für den Radioimmunoassay (RIA) wurde TME-ScNMP als Tracer mit 125I markiert. Diese Markierung erfolgte nach der Chloramin T Methode [134]. Der Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen: 31,5 µl TME-ScNMP (800 pmol), 9,5 µl Na125I (37 MBq, 400 pmol) und 500 ng Chloramin T (775 pmol). Der Reaktionsansatz wurde in einem Gesamtvolumen von 100 µl 500 mM Phosphatpuffer (KH2PO4, pH 7,4) aufgenommen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Chloramin T gestartet und nach 50 Sekunden mit 100 µl 2,6 µM Na-Bisulfit gestoppt. Nach Zugabe von 200 µl H2O dest., wurde der Reaktionsansatz auf eine QAE-Säule (QAE Sephadex A-25, GE Healthcare, Uppsala, SW) gegeben, die zuvor mit 50 mM Ammoniumformiatpuffer (pH 6,0) äquilibriert wurde. Die Elution erfolgte mit 250 mM Ammoniumformiatpuffer (pH 6,0) in 5 ml Fraktionen. Die Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität wurden vereinigt und mit einem Volumen Isopropanol versetzt.

3.2.2.2 Probenvorbereitung zur Bestimmung der intrazellulären cNMP Konzentration von Aortenringen

(38)

3.2.2.3 Radioimmunoassay (RIA) zur quantitativen Bestimmung von zyklischem 3’:5’-Adenosin-/ Guanosinmonophosphat

Die Durchführung erfolgte nach der Methode von Steiner [135]. Zur Erhöhung der Sensitivität des Assays wurden die unter 2.2.2.2 hergestellten Proben und der Standard (2-512 fmol cNMP) mit 2 µl Triethylamin und 1 µl Acetanhydrid acetyliert. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes war 200 µl und setzte sich wie folgt zusammen: 10 µl Probe/Standard, 50 µl RIA-Puffer, 100 µl Antiserum (verdünnt in 0,5 mg/ml

γ-Globulinlösung) und 40 µl Tracer (verdünnt in RIA-Puffer, Gesamtaktivität etwa 9.000 cpm). Als Nullwert wurde 10 µl RIA-Puffer anstatt der Proben verwendet, als Gesamtaktivität wurde 40 µl Tracer verwendet. Der Ansatz wurde für mindestens 3 h oder ü.N. bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation erfolg te die Proteinfällung mit Hilfe von 3 ml Polyethylenglycolpuffer (16 % (w/v) PEG 6000, 10 mM TRIS/HCl, pH 7,5) und 50 µl 0,8 %

γ-Globulinlösung für 30 min bei 4 °C. Nach der Inkub ation wurden die Proben 30 min bei 6.000x g (4 °C) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Aktivität in den Sedimenten mit Hilfe eines γ-Counters gemessen.

3.2.2.4 Herstellung von 32P-cGMP

Radioaktives α-32P-GTP wurde mit Hilfe gereinigter NO-sensitiver Guanylyl-Cyclase zu 32P-cGMP umgesetzt. Der Reaktionsansatz hatte ein Gesamtvolumen von 100 µl und setzte sich wie folgt zusammen: 18,5 MBq α-32P-GTP, 50 mM TEA (pH 7,4), 0,5 mg/ml BSA, 3 mM DTT, 3 mM MgCl2, 1 mM S-Nitrosoglutathion (GSNO) und 2,5 µg gereinigte Guanylyl-Cyclase. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 450 µl Zn-Acetat (120 mM) und Na2CO3 (120 mM) gestoppt. Nach einer Zentrifugation (4 min, 12.000x g, RT) wurde der Überstand auf eine Aluminiumoxidsäule, die mit 0,1 M Perchlorsäure äquilibriert war, gegeben. Die Säule wurde mit 10 ml H2O dest. gewaschen und anschließend mit 250 mM Na-Acetat in 300 µl-Schritten eluiert. Die Tracerkonzentration wurde mit einem β-Counter (Packard 1600-TR) gemessen.

3.2.2.5 Bestimmung der cGMP-abbauenden Phosphodiesteraseaktivität

(39)

3.2.2.4) wurde so eingestellt, dass die Gesamtaktivität nicht mehr als 100.000 cpm betrug. Die Reaktion erfolgte für 5 min bei 37 °C und wurde anschließend mit 900 µl Aktivkohle (30 % Aktivkohlepulver (w/v), 50 mM KH2PO4, pH 2,3) abgestoppt. Nach einer Zentrifugation (4 min, 12.000x g, RT) wurden 600 µl des Überstands mit Hilfe eines β -Counters gemessen.

Die Phosphodiesteraseaktivität wurde wie folgt berechnet:

(

)

t V S C C C PDE v t × × − = 0

v(PDE): spezifische Aktivität (pmol/min/ml), C: Zählrate der Probe (cpm), C0: Zählrate des Leerwertes (cpm), T: Inkubationsdauer (min), Ct: Zählrate des eingesetzten [32P]-cGMP (cpm), S: eingesetzte Substratmenge (pmol), V: Probenvolumen pro Reaktionsansatz (ml)

3.2.2.6 Bestimmung der Guanylyl-Cyclaseaktivität

Der Reaktionsansatz zur Bestimmung der Guanylyl-Cyclaseaktivität hatte ein Gesamtvolumen von 100 µl und setzte sich wie folgt zusammen: 50 mM TEA (pH 7,4), 0,5 mg/ml BSA, 3 mM DTT, 3 mM MgCl2, 1 mM IBMX, 5 mM Creatinphosphat, 8 U Creatinkinase, 250 µM GTP und 3 µg Aortenhomogenat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µM DEA-NO gestartet, die Inkubation erfolgte für 10 min bei 37 °C. Zum Abstoppen der Reaktion wurden die Proben auf 95 °C erhitzt. Die umgesetzte Menge an cGMP wurde anschließend mit einem Radioimmunoassay bestimmt (siehe 3.2.2.3).

3.2.3 Organbadexperimente

3.2.3.1 Präparation

Mit Hilfe von Organbadexperimenten kann die Vasorelaxation und die Vasokonstriktion von Aortenringen ex vivo untersucht werden. Für die Organbadexperimente wurde stets der thorakale Abschnitt der Aorta verwendet, die entnommenen Aorten wurden sofort in physiologische K-H-Lösung überführt, von umliegendem Gewebe befreit und in möglichst gleich große Ringe geschnitten.

3.2.3.2 Experimenteller Ablauf der Organbadexperimente

(40)

von 5 mN für 30 min äquilibriert. Infolge des spontanen Gefäßtonus wurden die Gefäße während der Äquilibrierungsphase nachjustiert. Beim Erlangen einer stabilen Kraft, wurde mit den Experimenten begonnen. Gemessen wurde die Kraftentwicklung (Kontraktion) oder der Kraftabbau (Relaxation) der Aortenringe in mN (Software: Myodaq 2.0 bzw. Labchart6). Die Auswertung erfolgte mit den Programmen Myodata 2.0, Labchart Reader7 und Excel. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Programms SPSS.

3.2.3.3 Aufnahme von Konzentrations-Wirkungs-Kurven

Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurden kumulativ mit steigender Konzentration aufgenommen. Bei Vasokonstriktoren wurde die maximal erhaltene Kraft abzüglich der Basislinie als 100 % definiert. Die übrigen Werte wurden relativ zu der maximalen Kontraktion in Prozent berechnet und die halblogarithmische Konzentration des Agonisten gegen die Kontraktion aufgetragen. Für die Aufnahme der Konzentrations-Wirkungs-Kurven von Vasodilatoren wurden die Aortenringe mit 1 µM Phenylephrin vorkontrahiert. Nach einer vollständigen Kontraktion wurde die Wirkung der Vasodilatoren in aufsteigender Konzentration gemessen. Die maximal erreichte Kontraktion wird als 100 % gesetzt und die jeweiligen Dosen der Vasodilatoren in Prozent der Kontraktion ausgedrückt. Anhand der Kurven konnte der EC50-Wert bestimmt werden. Bei dem EC50-Wert handelt es sich um die halbmaximal effektive Konzentration, die dem Wendepunkt der Kurve entspricht. Durch die Zugabe des NO-Synthase Inhibitors L-NAME wurde der Einfluss von endogenem NO ausgeschlossen. Durch die Zugabe von Diclofenac wurde die Produktion vasorelaxierendem Prostaglandin (PGI2) gehemmt. Die Konzentrationsbereiche der Konzentrations-Wirkungs-Kurven und die zugegebenen Inhibitoren sind Tabelle 6 zu entnehmen.

Tabelle 6: Durchgeführte Konzentrations-Wirkungs-Kurven

Substanz Dosen Zusatz

Carbachol 0,01 - 30 µM 3 µM Diclofenac

DEA-NO 0,001 - 1 µM 200 µM L-NAME

Forskolin 0,001 - 1 µM 200 µM L-NAME

(41)

3.2.4 Messung des peripheren Gefäßwiderstandes

Zur Messung des peripheren Gefäßwiderstandes wurden die Hinterbeine der Maus bei einem konstanten Fluss durchströmt und der Druck mit Hilfe eines Druckaufnehmers gemessen. Die Mäuse wurden vor dem Versuch mit 200 µl Heparin (50 U/ml) behandelt. Anschließend wurden die Tiere mit CO2 betäubt und dekapitiert. Die Tiere wurden in eine 37 °C-Kammer gelegt (Moist Chamber, Havard Apparatu s), und die Aorta für die Kanulierung freigelegt. Die Kanulierung der Aorta erfolgte unterhalb der Nieren, um ein Durchströmen dieser ausschließen zu können. Das Tier wurde mit K-H-Lösung durchströmt (37 °C, mit Carbogen begast) und die Ve ne aufgeschnitten, um ein Austreten der K-H-Lösung zu ermöglichen. Die Perfusion erfolgte mit Hilfe einer Rollerpumpe (Abimed) und der entstandene Druck wurde mit einem Druckaufnehmer (APT 300, Havard Apparatus) mittels der Labchart6 Software in mmHg aufgezeichnet. Die Auswertung erfolgte mit den Programmen Labchart-Reader6 und Excel.

Abbildung 6: Experimenteller Aufbau zur Messung des peripheren Gefäßwiderstandes in den Hinterbeinen der Maus

Mit Hilfe einer Rollerpumpe wird die Krebs-Henseleit-Lösung, die in einem Pufferreservoir begast und erwärmt wird, durch das System gepumpt. Die K-H-Lösung wird über eine Kanüle durch die Aorta gepumpt und der entstehende Widerstand, in den Hinterbeinen, mit Hilfe eines Druckaufnehmers in mmHg gemessen.

(42)

3.2.5 Behandlung von Mäusen mit kontraktilen Faktoren

Die Behandlung von Mäusen mit kontraktilen Faktoren erfolgte mit Hilfe von osmotischen Minipumpen. Die Pumpen ermöglichen eine konstante Abgabe von Agonisten über einen Zeitraum von zwei Wochen.

3.2.5.1 Befüllen von osmotischen Minipumpen

Die Pumpen wurden unter sterilen Bedingungen nach Herstellerangabe befüllt (Alzet Modell 1002). Die Konzentration an Angiotensin II (gelöst in 0,9 % (w/v) NaCl) wurde so gewählt, dass die Pumpe 1,44 mg/kg Körpergewicht pro Tag über einen Zeitraum von zwei Wochen abgibt. Noradrenalin (gelöst in 70 mM HCl und 0,9 % (w/v) NaCl) wurde in einer Konzentration von 2,88 mg/kg Körpergewicht pro Tag abgegeben. Nach dem Befüllen wurden die Pumpen ü.N. bei 37 °C in steril er 0,9 % (w/v) NaCl-Lösung gelagert.

3.2.5.2 Einsetzen von osmotischen Mini-Pumpen

Für das Einsetzen der osmotischen Minipumpen wurden die Mäuse mit einem Gemisch aus Ketamin und Xylazin (100 mg Ketamin und 2 mg Xylazin pro kg Körpergewicht) narkotisiert. Im Nacken wurde das Fell abrasiert und ein Schnitt gesetzt. Die osmotischen Minipumpen wurden subkutan in die Hauttasche implantiert und der Schnitt anschließend zugenäht.

3.2.5.3 Blutdruckmessung

Die Blutdruckmessung wurde mit Hilfe eines Schwanzmanschetten-Plethysmographen (Softron BP-98A, Softron Tokio, J) durchgeführt. Während der Messung wurden die Mäuse in einem Handschuh fixiert und in eine Kammer (37 °C) gesetzt. Der Blutdruck wurde vor und nach der Behandlung aufgenommen. Pro Tag wurden 10 Messzyklen durchgeführt.

3.2.6 Behandlung von Mäusen mit Sildenafil

(43)

wurden gemörsert und in der entsprechenden Menge Trinkwasser, mit Zitronensäure versetzt (etwa pH 3,5), aufgelöst. Die Sildenafilbehandlung erfolgte für eine Woche parallel zu der Angiotensin II-Behandlung (Punkt 2.2.5).

3.2.6.1 Bestimmung der Sildenafilkonzentration im Plasma der behandelten Mäuse

Um sicher zustellen, dass die Sidenafilbehandlung erfolgreich war, wurden die Sildenafilkonzentration im Plasma der Mäuse bestimmt. Die Bestimmung der Plasmakonzentration wurde mit Hilfe einer in HEK-Zellen überexprimierten PDE5 nach dem Protokoll von Jäger et al. durchgeführt [136]. Die Aktivitätsbestimmung der PDE5 erfolgte wie unter 2.2.2.5 beschrieben. Die gemessene Plasmakonzentration lag bei 10 nM, diese entspricht dem IC50 der PDE5 gegenüber Sildenafil.

Abbildung 7: Bestimmung der Sildenafilkonzentration im Plasma der behandelten Mäuse

Die Bestimmung der Sildenafilkonzentration wurde im Plasma der behandelten Mäuse mit Hilfe einer in HEK-Zellen exprimierten PDE5 untersucht. Das Plasma der Mäuse zeigt den gleichen Effekt wie 10 nM Sildenafil.

3.2.7 Bestimmung des Noradrenalingehaltes in Plasma und Urin

3.2.7.1 Probenvorbereitung

Für die Plasmagewinnung wurde das Blut der dekapitierten Tieren aufgefangen, mit 3 mM EDTA versetzt und anschließend sedimentiert (15 min, 10.000x g, 4°C). Die Proben setzten sich wie folgt zusammen: 100 µl Plasma, 800 µl Milli-Q-Wasser, 500 µl Mix (1 M HCl, 67 mM Na2EDTA, 1 M Na2SO3), 300 µl TRIS/HCl (2 M, pH 8,2) und 100 µl DHBA-Standard (DHBA 12 pg/µl, Chromsystems, München). Die Uringewinnung erfolgte

(44)

mit Hilfe von Stoffwechselkäfigen. Es wurde ein Volumen von 50 µl mit 1 ml H2O dest. und 100 µl DHBA-Standard versetzt. Die Lagerung der Nordrenalin-Proben erfolgte bei -20 °C.

3.2.7.2 Isolierung des Noradrenalins aus den Plasma- und Urinproben

Die aufgetauten Proben wurden in ein 15 ml Zentrifugationsgefäß überführt und der pH-Wert mit 1 M TRIS/HCl pH 10,0 auf pH 8,4 eingestellt. Zu den Proben wurden 50 mg Aluminiumoxid (Recipe, München) gegeben und anschließend 40 min über Kopf geschüttelt (4 °C). Nach einer Zentrifugation (5 mi n, 800x g, RT) wurde der Überstand auf einen Glasfaser-Filter (Macherey-Nagel) gegeben und zweimal mit je 1 ml H2O dest. gewaschen (5 min, 4.000x g, RT). Der Durchlauf wurde verworfen und das Noradrenalin zunächst mit 150 µl und anschließend 100 µl 0,1 M Perchlorsäure eluiert (10 min, 4.000x g, RT).

3.2.7.3 Messung des Noradrenalingehaltes mittels HPLC

Die Noradrenalinmessung erfolgte mittels HPLC (high performance liquid chromatography) im Institut für experimentelle Nephrologie an der Universität Düsseldorf.

Von den eluierten Noradrenalinproben wurden 125 µl computergesteuert in das HPLC-System injiziert. Das HPLC-HPLC-System bestand aus eine Pumpe (Waters 600 Controller), einem automatischen Injektor (Waters 717 plus Autosampler), einem Detektor (Waters 460 Electrochemical Detector), einer Vorsäule (Waters Guard-Pack, ResloveTM C18) und der Trennsäule (WiCom, Prontosil, 120-5 C18 AQ 5,0 µm). Die mobile Phase wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min durch das System gepumpt und enthielt 15 mM NaH2PO4, 30 mM Zitronensäure, 2 mM Na2EDTA, 2,77 mM (-)Natriumoctylsulfonat und 12 % (v/v) Methanol, pH 6,5.

3.2.7.4 Auswertung des Noradrenalingehaltes

(45)

4 Ergebnisse

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion kontraktiler Faktoren mit der NO/cGMP-vermittelten Signaltransduktion in Wildtyp- und NO-GC1 Knockout-Mäusen, in denen die

α1-Untereinheit der löslichen Guanylyl-Cyclase und damit die Hauptisoform der GC genetisch ausgeschaltet ist, untersucht. Dabei sollte eine Behandlung der KO-Mäuse mit kontraktilen Faktoren Auskunft über mögliche Interaktionen mit der NO/cGMP-Signaltransduktion geben. Dafür wurden die Mäuse über einen Zeitraum von zwei Wochen mit Angiotensin II (Ang II) bzw. Noradrenalin (NA) behandelt, und die Interaktion durch mögliche Änderungen cGMP-vermittelter physiologischer Effekte (Vasorelaxation, Vasokonstriktion und Blutdruckregulation) untersucht. Zusätzlich wurden durch Ang II-induzierte Veränderungen in der Regulation oder Expression der Enzyme, die an der NO/cGMP-Signaltransduktion beteiligt sind, im Detail untersucht. Es ist bekannt, dass Ang II zu einer Reduzierung der intrazellulären cGMP-Spiegel führt. Als Ursache für die reduzierten cGMP-Spiegel wird eine erhöhte PDE-Aktivität oder Expression genannt [137]. Diese Aussage sollte durch eine gleichzeitige einwöchige Behandlung mit dem Arzneistoff Sildenafil (Viagra®) und einer möglichen Erhöhung der cGMP-Spiegel bestätigt werden. Sildenafil führt zu einer Hemmung der PDE5-Aktivität und so zu einer Erhöhung der cGMP-Spiegel. Durch die Behandlung sollte versucht werden, die Ang II-induzierten Effekte aufzuheben.

4.1 Morphologische Veränderungen durch die Angiotensin

II-Behandlung

Ang II ist nicht nur ein kontraktiler Faktor, sondern initiiert auch eine Vielzahl von Signalwegen, die charakteristische strukturelle Organveränderungen verursachen. Deswegen wurden im Rahmen dieser Arbeit die morphologischen Veränderungen durch die Ang II-Behandlung (1,44 mg/kg/d, 2 Wochen) erfasst. Charakteristisch ist zum Beispiel die Bildung von abdominalen Aortenaneurysmen oder die Entstehung einer Herzhypertrophie.

4.1.1 Herzhypertrophie

Abbildung

Updating...

Referenzen

Updating...

Verwandte Themen :