Anreicherung, Charakterisierung und in vivo Evaluation von Single-Chain-Antikörperfragmenten gegen oberflächenspezifische Proteine der Beta-Zelle

Volltext

(1)

Single-Chain-Antikörperfragmenten gegen

oberflächenspezifische Proteine der Beta-Zelle

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt in der

(2)

Enrichment, characterisation and in vivo evaluation of

single-chain-antibody fragments against

surface proteins of the beta-cells

Dissertation to obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr.rer.nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology

Ruhr-University Bochum

International Graduate School of Biosciences

Ruhr-University Bochum

Medical clinic I/Endocrinology/Diabetology

University Hospital Bergmannsheil

(3)
(4)

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis...IV

Abbildungsverzeichnis...VIII

Tabellenverzeichnis...IX

1

Einleitung... 1

1.1 Diabetes mellitus...1

1.2 Aufbau und Funktion der Bauchspeicheldrüse ...2

1.3 Bisherige Versuche zur nicht-invasiven Bestimmung der BZM in vivo ..4

1.3.1 Anforderungen an ein Beta-Zell Kontrastmittel...4

1.3.2 Positronen Emissions Tomographie (PET). ...5

1.3.3 Evaluierte Beta-Zell Kontrastmittel...6

1.4 Phage-display-Technologie ...7

1.4.1 Phagenbiologie ...8

1.4.1.1 M13-Phage ...8

1.5 Antikörper ...8

1.5.1 Antikörper Phage-display...10

1.6 Humane SCA Bibliothek I ...10

1.6.1 Selektionsverfahren ...11

1.7 Bestimmung der CDRs (nach Kabat et al., 1987) ...12

1.8 Zielsetzung...13

2

Material und Methoden ... 15

2.1 Material ...15

2.1.1 Chemikalien...15

2.1.2 Antibiotika ...16

2.1.3 Medien und Zusätze für die Zellkultur ...16

2.1.4 Verbrauchsmaterialien...16 2.1.5 Bakterien...17 2.1.6 SCA-Bibliothek ...17 2.1.7 Zelllinien...17 2.1.8 Versuchstiere ...17 2.1.9 Humane Pankreasschnitte...18 2.1.10 Antikörper...18 2.1.11 Oligonukleotide ...18 2.1.12 Reagenzsysteme...18

2.1.13 Enzyme und Größenstandard...19

2.1.14 Radioaktivität...19

2.1.15 Lösungen und Medien für das Arbeiten mit der Tomlinson-Bibliothek ...19

(5)

2.1.17 Puffer für die Histologie ...21

2.1.18 Lösungen und Puffer für den Western-Blot ...22

2.1.19 Medien für die Inselisolierung...23

2.1.20 Geräte ...23

2.2 Methoden ...25

2.2.1 Zellkultur ...25

2.2.1.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellkulturen...25

2.2.1.2 Kryokonservierung von eukaryontischen Zellen...25

2.2.1.3 Auftauen von eukaryontischen Zellen...25

2.2.1.4 Passagieren von eukaryotischen Zellen...26

2.2.2 Isolierung Insel-spezifischer-Phagen Klone (ISPC) mittels Phage-display Technologie...26

2.2.2.1 Herstellung und Titern des M13 Helferphagenstocks ...26

2.2.2.2 Amplifizierung und Titern der Phagenbibliothek I ...27

2.2.3 Selektionsverfahren ...28

2.2.3.1 In vivo „Phage-display“ ...28

2.2.3.2 In vitro „Phage-Display“ (an isolierten Inseln)...29

2.2.3.3 In vitro „Phage-Display“ (an eukaryontischen Zelllinien) ...29

2.2.4 Amplifizierung der selektierten Phagen ...29

2.2.5 Proteinbiochemische Methoden ...30

2.2.5.1 Expression löslicher SCA...30

2.2.5.2 Präparation und Aufreinigung von SCA aus Bakterien 30 2.2.5.3 Proteinbestimmung nach Bradford...31

2.2.5.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese .32 2.2.5.5 Nachweis der SCA-Aufreinigung mittels Coomassie-Brilliantblau-Färbung ...32

2.2.5.6 Western-Blot...33

2.2.6 Molekularbiologische Methoden...33

2.2.6.1 Plasmidisolierung im analytischen Maßstab ...33

2.2.6.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase-chain-reaction) ...33

2.2.6.3 Agarose-Gelelektrophorese ...34

2.2.6.4 DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen...34

2.2.6.5 Aufreinigung und Konzentrierung von DNA...35

2.2.6.6 DNA-Konzentrationsbestimmung...35

2.2.6.7 Sequenzierung ...35

2.2.7 Isolierung von Langerhans`schen Inseln der Ratte...35

2.2.8 Lokalisierung der ISPC und SCA...36

2.2.8.1 In vivo Lokalisierung der ISPC und SCA...36

2.2.8.2 Immunhistochemische Färbungen an Paraffin-Schnitten36 2.2.8.3 Elektronenmikroskopie...37

2.2.9 Charakterisierung des Bindungsverhalten der ISPC und SCA...39

2.2.9.1 Zellbasierter Bindungs-Assay ...39

(6)

2.2.9.3 In vitro Radioaktivitäts-Bindungs-Assay ...40

2.2.9.4 Pharmakokinetik...40

2.2.10 Diabetesinduktion...40

2.2.11 Biodistribution der SCA in vivo und Bestimmung der BZM ...41

2.2.12 Intraperitonealer Glukose Toleranztest (IPGTT) ...41

2.2.13 Insulin-ELISA ...41

2.2.14 Glukagon-ELISA...41

2.2.15 Apoptose- und Viabilitäts-Test...41

2.2.16 PET von [124I]-markiertem SCA 1 in gesunden und diabetischen Ratten ...42

2.2.17 Statistik ...42

3

Ergebnisse... 43

3.1 Generierung Beta-Zell spezifischer SCA mit Hilfe der Phage-display Technologie...43

3.2 Bestimmung der Beta-Zell Spezifität der ISPC in vitro ...46

3.3 Bestimmung der Beta-Zell Spezifität der ISPC in vivo ...47

3.4 SCA Herstellung ...50

3.5 Evaluation der Target-Zell-Spezifität der SCA in vivo...50

3.6 Selektive Bindung der SCA an humane Inseln in situ...52

3.7 Subzelluläre Lokalisation der SCA...52

3.8 Bindungseigenschaften der radioaktiv-markierten SCA in vitro und ihr pharmakokinetisches Profil in vivo...54

3.9 In vivo Toxiziäts-Tests...57

3.10 Quantifizierung der BZM mittels radioaktiv markiertem SCA in vivo ..60

3.11 PET von [124I]-markiertem SCA 1 in gesunden und diabetischen Ratten61

4

Diskussion... 63

4.1 Theoretische Aspekte zur Darstellung der humanen BZM...63

4.2 Antikörper (AK) gegen Insel-spezifische Oberflächenproteine ...65

4.3 Neu-Entwicklung Insel-spezifischer SCA ...66

4.4 Bestimmung der Beta-Zell Spezifität der neu entwickelten Liganden in vitro und in vivo ...67

4.5 Nachweis der Target-Zell-Spezifität in vivo und intrazelluläre Lokalisierung der neu entwickelten SCA 1-7...68

4.6 Bindungseigenschaften der [125I]-markierten SCA in vitro und pharmakokinetisches Profil in vivo...68

4.7 Selektive Bindung der SCA an humane Inseln und fehlende Toxizität..69

4.8 Quantifizierung der BZM mittels [125I]-markierten SCA 1 ...70

4.9 Einsatz des SCA 1 als Beta-Zell Kontrastmittel zur nicht-invasiven Bestimmung der BZM in vivo mittels PET...70

5

Zusammenfassung ... 72

6

Summary ... 74

(7)
(8)

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematischer Aufbau der humanen Bauchspeicheldrüse (Pankreas)

und angrenzenden Organen. ...3

Abbildung 2: Schematischer Aufbau einer Langerhans`schen Insel ...4

Abbildung 3: Beispiel eines rekonstruierten PET-Bildes nach i.v. Injektion eines potentiellen Beta-Zell spezifischen Kontrastmittel in einem gesunden Probanden. ...6

Abbildung 4: Schematischer Aufbau des M13-Phagen. ...8

Abbildung 5: Schematische Darstellung von Antikörperformen. ...9

Abbildung 6: Vektorkarte von pIT2 ...11

Abbildung 7: Schematische Darstellung des Phage-disply Screenings. ...12

Abbildung 8: Anreicherung insel spezifischer Phagen mittels “Phage-display-Screening“ in vivo und in vitro...43

Abbildung 9: Sequenzen von ISPC 1-7. ...46

Abbildung 10: Bestimmung der Beta-Zell Spezifität in vitro. ...47

Abbildung 11: Intrapankreatische Lokalisierung der ISPC in vivo...48

Abbildung 12: Lokalisierung der ISPC in den Kontrollorganen in vivo ...49

Abbildung 13: SCA Aufreinigung aus HB2151 Bakterien...50

Abbildung 14: Lokalisierung der SCA im Pankreas in vivo ...51

Abbildung 15: Lokalisierung der SCA in den Kontrollorganen in vivo. ...51

Abbildung 16: Lokalisierung der SCA im humanen Pankreas in situ...52

Abbildung 17: Kontroll-Pankreas nach i.v. Injektion des SCA 1 bzw. SCA 353 Abbildung 18: Subzelluläre Lokalisierung von SCA 1 und SCA 3. ...54

Abbildung 19: Bindungsverhalten der selektierten [125I]-markierten SCA an verschiedenen endokrinen und exokrinen Pankreas-Zelllinien in vitro...55

Abbildung 20: Präinkubations Assay und Dosiswirkungskurve des [125I ]-markierten SCA 1 und SCA 3. ...56

Abbildung 21: Zeitverlauf der Elimination von SCA 1 und SCA 3 aus dem vaskulären System. ...57

Abbildung 22: Wirkung der SCA auf die Insel-Funktion in vivo...58

Abbildung 23: Wirkung der SCA auf die Zell-Viabilität in vitro. ...59

(9)

Abbildung 26: Schematische Darstellung potentieller Beta-Zell spezifischer Proteine/Rezeptoren, die als Target für die nicht-invasive Bestimmung der BZM bereits evaluiert wurden...64

Tabellenverzeichnis

(10)

1 Einleitung

Der autoimmun-bedingte progrediente Verlust der pankreatischen, Insulin- produzierenden Beta-Zellen ist die zentrale Ursache für die Entstehung des Typ 1-Diabetes. Bei Patienten mit Typ 2-Diabetes tritt im Verlauf der Erkrankung ebenfalls eine Reduktion der BZM (Beta Zell Masse) auf, die durch eine erhöhte Apoptoserate bedingt zu sein scheint (Weier et al., 1990; Butler et al., 2003). Daraus resultiert, dass alle Typ 1-Diabetiker, aber auch viele betroffene Typ 2-Diabetiker im Verlauf der Erkrankung eine Insulintherapie durchführen müssen. Mit keiner verfügbaren Therapie (z.B. Insulin, orale Antidiabetika) ist es weder beim Typ 1- noch beim Typ 2-Diabetes bisher kausal gelungen, den Verlust der BZM aufzuhalten. Diese pathophysiologischen Zusammenhänge haben zu dem Bedürfnis geführt, die BZM nicht-invasiv in vivo beim Menschen zu bestimmen (Schneider, 2008). Darüber hinaus gibt es Hinweise aus Tiermodellen, dass neu verfügbare Antidiabetika z.B. GLP-1 Analoga (Glucagon-Like

Peptide-1), DPP4-Hemmer (Dipeptidyl Peptidase-4) etc. scheinbar in der Lage sind

diesen Verlust zu stoppen (Stoffers et al., 2000; Mu et al., 2006; Meier, 2008). Um den Einfluss dieser Therapien auf die BZM auch beim Menschen untersuchen zu können, sowie ein besseres Verständnis für den Zusammenhang von BZM, Beta-Zellfunktion und Glukosestoffwechsel zu entwickeln, wäre eine nicht-invasive Methode sehr hilfreich, die aber gegenwärtig noch nicht zur Verfügung steht (Schneider, 2008).

Da die Sensitivität der Radionuklid-Bildgebung sehr hoch ist (liegt im Bereich von Pikomol; Cassidy et al., 2005), wird nach den vorliegenden Erkenntnissen die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) die Bildgebungs-Modalität sein, die erstmals die nicht-invasive Bestimmung der BZM des Pankreas beim Menschen in vivo erlauben wird. Bisher scheiterte das Vorhaben aber am Fehlen eines Beta-Zell spezifischen Kontrastmittels (Schneider, 2008), das im Rahmen der dargestellten Arbeit entwickelt werden konnte.

1.1 Diabetes mellitus

(11)

Betroffenen bis auf 4,4% erhöhen wird. Dies bedeutet, dass die Anzahl der Erkrankten von 171 Millionen auf 366 Millionen weltweit steigen wird (Wild et al., 2004). Der Diabetes mellitus basiert auf chronisch erhöhten Blutglukosewerten (Hyperglykämie), die bedingt sind durch Defekte der Insulinsekretion, der Insulinwirkung oder beidem zusammen. Man unterscheidet verschiedene Formen des Diabetes mellitus auf Grund der Ursachen und dem Verlauf. 1997 wurde von der American Diabetes Association (ADA) eine Klassifikation der verschiedenen Typen vorgenommen und im Konsensus im Jahr 2000 von der Deutschen Diabetes Gesellschaft (DDG) bestätigt. Dabei stellen eine eingeschränkte Glukosetoleranz und beeinträchtigter Fett- und Kohlenhydrat-Stoffwechsel Gemeinsamkeiten dar. Man unterscheidet hauptsächlich zwischen Typ 1- und Typ 2-Diabetes mellitus (Mehnert et al., 1999).

Der Typ 1-Diabetes mellitus liegt bei ca. 5-7% aller Diabetesfälle vor (Wild et al., 2004). Er beruht auf einer Autoimmunreaktion, welche zur Zerstörung der Insulin-produzierenden Beta-Zellen des Pankreas führt und manifestiert sich meistens schon im Kindesalter (Weier et al., 1990). Betroffene Patienten benötigen immer exogenes Insulin zum Überleben, da sie einen absoluten Beta-Zellverlust aufweisen und somit eine komplett fehlende endogene Insulinsekretion.

Der Typ 2-Diabetes mellitus liegt bei ca. 85% aller Diabetesfälle vor (Wild et al., 2004). Er beruht auf dem Verlust der Schlüsselfunktion der Beta-Zellen wie z.B. die Glukose stimulierte Insulin Sekretion (GSIS) und einem allmählichen Verlust der BZM durch einen bisher nicht vollständig aufgeklärten Mechanismus (Butler et al., 2003; Marchetti

et al., 2004). Betroffene Patienten leiden häufig zusätzlich an Adipositas. Zunächst wird

eine Diät und Gewichtsreduktion angestrebt. Wenn dies nicht ausreicht wird eine orale medikamentöse Behandlung notwendig und bei fortgeschrittener Erkrankung wird des Weiteren ein Insulinpräparat eingesetzt.

1.2 Aufbau und Funktion der Bauchspeicheldrüse

(12)

zur Milz. Das Pankreas besitzt aufgrund seiner Funktion als Verdauungsdrüse einen Ausführungsgang, der zusammen mit dem von der Leber und Gallenblase kommenden Gallengang in die Papille mündet, die dann in den Zwölffingerdarm mündet. Der Ausführungsgang ist 2 mm breit und in ihn münden die aus den Pankreasläppchen führenden kurzen Zuflüsse (Welsch, 2006).

Abbildung 1: Schematischer Aufbau der humanen Bauchspeicheldrüse (Pankreas) und angrenzenden

Organen.

Schematischer Aufbau des Pankreas und anliegenden Magen und Leber. Das Pankreas ist in Kopf-, Körper- und Schwanz- Teil unterteilt (aus http://www.essom.com).

(13)

Abbildung 2: Schematischer Aufbau einer Langerhans`schen Insel

Eine Langerhans`sche Insel setzt sich aus 4 endokrinen Zelltypen zusammen: 1) Glukagon-produzierenden Alpha-Zellen (grün); 2) Insulin-Glukagon-produzierenden Beta-Zellen (rot); 3) Somatostatin-produzierenden Delta-Zellen (gelb); 4) pankreatische Polypeptid-Somatostatin-produzierenden Zellen (rosa) (modifiziert nach Welsch, 2006).

Eine Langerhans`sche Insel ist 100-200 µm groß und ist aus 2000-3000 endokrinen

Zellen verschiedenen Typs zusammengesetzt (vgl. Abb. 2). Man unterscheidet 4 endokrine Zelltypen: Die Glukagon-produzierenden Alpha-Zellen, die

Insulin-produzierenden Beta-Zellen, die Somatostatin-Insulin-produzierenden Delta-Zellen und die pankreatischen Polypeptid-produzierenden Zellen (Weir et al., 1990; Welsch, 2006). Die Alpha-Zellen umfassen ca. 20%, die Beta-Zellen ca. 70%, die Delta-Zellen 10% und die pankreatische Polypeptid-Zellen 1-2% der Inselzellmasse (Welsch, 2006). Insulin und Glukagon sind Gegenspieler und beeinflussen den Kohlenhydratstoffwechsel und somit den Glukosegehalt im Blut (Blutzucker). Insulin senkt den Blutglukosespiegel, indem es während oder nach einer Mahlzeit ausgeschüttet wird. Es fördert die Aufnahme und Verwertung von Glukose durch Leber-, Fett- und Muskelzellen, beeinflusst den Fettstoffwechsel, unterstützt den Aufbau von Eiweiß und fördert das Wachstum. Glukagon hat insulinantagonistische Wirkungen, indem es den Blutglukosespiegel durch Förderung des Glykogenabbaus in der Leber erhöht. Es stimmuliert in den Beta-Zellen die Insulinsekretion (Welsch, 2006).

1.3 Bisherige Versuche zur nicht-invasiven Bestimmung der BZM in vivo 1.3.1 Anforderungen an ein Beta-Zell Kontrastmittel

(14)

weiter ab. Zudem unterscheiden sich die Beta-Zellen nur wenig hinsichtlich Dichte und Echogenität von den exokrinen Zellen des Pankreas (Schneider, 2008). Die wichtigste Vorraussetzung für die Entwicklung eines erfolgreichen, nicht-invasiven Verfahrens zur Bestimmung der BZM in vivo ist deshalb die Entwicklung eines Beta-Zell spezifischen Kontrastmittels. Sweet et al. (2004) haben diesbezüglich Berechnungen präsentiert, wonach ein potentielles Kontrastmittel wenigstens eine Spezifität von 100:1 (Beta-Zellen vs. nicht Beta-(Beta-Zellen) haben muss, damit in vivo ein ausreichend hohes Signal-zu-Rausch Verhältnis erreicht werden kann. Um klinisch einsetzbar zu sein, sollte nach einer Übersichtsarbeit von Schneider (2008) das Kontrastmittel zudem die folgenden Eigenschaften besitzen: 1) eine hohe Bindungsaffinität und viele Bindungsstellen pro Beta-Zelle, sowie eine schnelle Elimination aus dem Organismus, 2) ein Target erkennen, dass auf humanen Beta-Zellen häufig exprimiert wird und proportional zur BZM ist und 3) keine Toxizität besitzen.

1.3.2 Positronen Emissions Tomographie (PET).

(15)

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 0 10 20 30 40 50 60

mean frame time p.i. (min)

ac tiv ity (B q/ cc ) A k ti v itä t ( B q /c c )

mittlerer Zeit–Rahmen p.i. (min) 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 0 10 20 30 40 50 60

mean frame time p.i. (min)

ac tiv ity (B q/ cc ) A k ti v itä t ( B q /c c )

mittlerer Zeit–Rahmen p.i. (min)

Anreicherung von Kontrastmittel im Pankreas (β-Zellen 1-2%, VZ 20%, EZ

78-79%) Leber

Abbildung 3: Beispiel eines rekonstruierten PET-Bildes nach i.v. Injektion eines potentiellen Beta-Zell

spezifischen Kontrastmittel in einem gesunden Probanden.

Abbildung 3: Beispiel eines rekonstruierten PET-Bildes nach i.v. Injektion eines potentiellen Beta-Zell

spezifischen Kontrastmittel in einem gesunden Probanden.

a) Anreicherung des potentiellen Beta-Zell spezifischen Kontrastmittels im Pankreas und in der Leber; b) Quantifizierung der Aktivität im Pankreas (■) und in der Leber (●) wird in der ROI während eines Scans in Zeit-Aktivität Kurven dargestellt. VZ= Vaskulärer Zwischenraum, EZ= exokrine Zellen (modifiziert nach Schneider, 2008).

a) Anreicherung des potentiellen Beta-Zell spezifischen Kontrastmittels im Pankreas und in der Leber; b) Quantifizierung der Aktivität im Pankreas (■) und in der Leber (●) wird in der ROI während eines Scans in Zeit-Aktivität Kurven dargestellt. VZ= Vaskulärer Zwischenraum, EZ= exokrine Zellen (modifiziert nach Schneider, 2008).

1.3.3 Evaluierte Beta-Zell Kontrastmittel 1.3.3 Evaluierte Beta-Zell Kontrastmittel

Trotz erheblicher Anstrengungen war es weder uns noch anderen Gruppen bisher gelungen ein Beta-Zell spezifisches Kontrastmittel zu identifizieren, dass die oben genannten Anforderungen erfüllt (Malaisse, 2001; Moore et al., 2001; Schirrmacher et

al., 2002; Sweet et al., 2004 a/b; Wängler et al., 2004 a/b; Schneider, 2008). Zunächst

sehr vielversprechende Daten wurden mit dem PET-Kontrastmittel [11C]DTBZ (Dihydroterabenazin) erzielt, der den Vesicular Monoamine Transporter 2 (VMAT2) als Beta-Zell-Target erkennt (Sipmson et al. 2006; Souza et al. 2006). Leider machen es kürzlich publizierte Daten sehr unwahrscheinlich, dass DTBZ sich eignet um die BZM beim Menschen zu bestimmen: 1) nur eine geringe Menge der pankreatischen Aufnahme des radioaktiv markierten DTBZ kann bei Ratten durch unmarkiertes DTBZ geblockt werden (Kung et al. 2007) und 2) die Aufnahme von [11C]DTBZ in das Pankreas von Patienten mit einem langjährigen Typ 1-Diabetes war nicht zu unterscheiden von nicht-diabetischen Kontrollen (Liu et al. 2007).

Trotz erheblicher Anstrengungen war es weder uns noch anderen Gruppen bisher gelungen ein Beta-Zell spezifisches Kontrastmittel zu identifizieren, dass die oben genannten Anforderungen erfüllt (Malaisse, 2001; Moore et al., 2001; Schirrmacher et

al., 2002; Sweet et al., 2004 a/b; Wängler et al., 2004 a/b; Schneider, 2008). Zunächst

(16)

Ein Kernproblem bei der Entwicklung neuer Beta-Zell spezifischer Kontrastmittel besteht darin, dass wenig über Beta-Zell spezifische Oberflächenmarker bekannt ist. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir uns der Phage-display-Technologie bedient.

1.4 Phage-display-Technologie

Die Phage-display-Technologie ist eine weit verbreitete Technik, um Polypeptid Binder gegen verschiedene Target-Zellen zu selektieren, auch ohne Kenntnis über spezifische Oberflächenproteine. Sie ermöglicht dabei eine schnelle Identifizierung und Charakterisierung der Polypeptide (de Wildt, 2000; Amstutz et al., 2001). Bei der

Phage-display-Technologie werden filamentöse Phagen als Vektoren benutzt, indem

(17)

1.4.1 Phagenbiologie 1.4.1.1 M13-Phage

M13-Phagen sind filamentöse Bakteriophagen und gehören zur Gruppe der Ff-Phagen (F-Pili, filamentös). Sie haben einen Durchmesser von 6,5 nm und sind 930 nm lang. Ihr Genom besteht aus einer einzelsträngigen, zirkulären, covalent geschlossenen DNA und besteht aus 6400 Nukleotiden, die in einem flexiblen Protein-Zylinder liegt. Der Zylinder besteht aus 2700 Molekülen des pVIII Proteins. An einem Ende des Zylinders befinden sich pVII und pIX Proteine und an dem anderen Ende befinden sich 5 Moleküle des pIII Proteins (vgl. Abb. 4).

Abbildung 4: Schematischer Aufbau des M13-Phagen.

Dargestellt sind die Hüllproteine pVIII, die pIII, pVII, pIX Proteine und die zirkuläre, einzelsträngige DNA. Des M13 Phagen (modifiziert nach Barbas et al., 2001).

M13-Phagen können nur E.coli Bakterien infizieren, welche einen F-Pilus haben, da über diesen die Infektion der Bakterien erfolgt. Sie sind keine lytischen Phagen, da sie nach der Freisetzung der reproduzierten Phagen die Bakterienzelle nicht zerstören. M13-Phagen nutzen die E.coli Bakterien somit nur als Wirt, in welchem sie sich vermehren (Model und Russel, 1988).

1.5 Antikörper

Antikörper gehören zur Gruppe der Immunglobuline. Ein Antikörper besteht aus zwei Arten von Polypeptidketten, einer leichten Kette (L) und einer schweren Kette (H,

heavy). Eine leichte Kette ist 25 kDa groß und eine schwere Kette 55 kDa. Ein

(18)

so die Antigen-Bindungs-Domäne. Dieser Aufbau verleiht dem Antikörper eine Y-förmige Struktur (vgl. Abb. 5).

Abbildung 5: Schematische Darstellung von Antikörperformen.

a) IgG Antikörper: CDRs (complimentarity determining regions); Fab-Fragment (variabler Teil); Fc

-Fragment (konstanter Teil); VH(variable schwere Kette); VL (variable leichte Kette); b) F(ab)2-Fragment; c)

(19)

Ein Fab (F= Fragment, ab= antigenbindend) besteht aus einer vollständigen leichten

Kette und dem aminoterminalen Abschnitt der schweren Kette. Jedes Fab stellt eine Antigenbindungsstelle dar. Der Fc-Teil besteht aus den carboxyterminalen Abschnitten

beider schweren Ketten und stellt einen konstanten Bereich dar. Die für die Antigenbindung verantwortlichen variablen Stellen der Fab reichen aus der Struktur

schleifenförmig heraus und werden Komplementarität-determierende Regionen (CDR;

complimentarity determining regions) genannt (Stryer, 1996). Mittels

molekularbiologischer Techniken lassen sich verschiedene Antikörperformate herstellen. Dazu gehören vollständige Immunglobuline (IgG), F(ab)2-Fragmente, welche

bivalent dem Antigen gegenüber auf Grund von zwei Antigenbindungsdomänen sind, Fab-Fragmente, die auf Grund einer Antigenbindungsdomäne monovalent sind,

Fv-Fragmente und SCA-Fv-Fragmente (Single-Chain-Antikörper). Die SCA-Fv-Fragmente bestehen lediglich aus einer variablen Domäne der schweren (VH) und leichten Kette

(VL), welche über einen flexiblen Abstandshalter miteinander verbunden sind. Der

Vorteil des Einsatzes von SCA-Fragmenten in einer Bibliothek beruht auf deren geringen Größe. Somit sind sie genetisch stabiler und in Bakterien leichter zu exprimieren. Nachteile ergeben sich aus der Bildung von Dimeren, welche sich auf Grund längerer Abstandshalter reduzieren lassen (Holliger et al., 1993).

1.5.1 Antikörper Phage-display

Bei dem Antikörper Phage-display werden Bibliotheken von Antikörperfragmenten (insbesondere Fab oder SCA) verwendet wobei die Fab oder SCA auf der Oberfläche von

Phagen exprimiert werden (Hoogenboom et al., 1992; Griffiths et al., 1994; Nissim et

al, 1994). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Phage-display-Technologie

zur Selektion Beta-Zell spezifischer Fragmente aus einer humanen SCA-Bibliothek von Tomlinson durchgeführt. Die SCA-Fragmente waren dabei in M13-Bakteriophagen kodiert.

1.6 Humane SCA Bibliothek I

(20)

M13 Phagen exprimiert. Die Variabilität der Bibliothek beruht auf Unterschiede in der leichten und in der schweren Kette: H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, L50, L53, L91, L92, L93, L94 und L95 (http://geneservice.co.uk/products/proteomic/datasheets/tomlinsonIJ.pdf).

Abbildung 6: Vektorkarte von pIT2

Das klonierte SCA-Gen liegt zwischen der NcoI- und NotI-Schnittstelle. Es wird am N-Terminus von einer Signalsequenz (pelB) und am C-Terminus von einem Myc-Tag flankiert. Ein LacZ-Promoter ist der Signalsequenz vorgeschaltet (lac Promoter) und eine Ribosomen-Bindestelle (RBS). Ein amber-Stopcodon trennt das Myc-Tag vom Phagenhüllprotein III kodierenden Gen (gIII). Des Weiteren sind Replikationsursprünge für E.coli (colE1 ori) und den M13 Phagen (M13 ori) sowie eine Ampicillin-Resistenz (Amp) vorhanden.

(modifiziert nach http://geneservice.co.uk/products/proteomic/datasheets/tomlinsonIJ. pdf).

1.6.1 Selektionsverfahren

(21)

erhöhen. Nach mehreren Runden dieses Prozesses werden individuelle Phagenklone ausgewählt und individuell per Sequenzanalyse analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde das dargestellte Selektionsverfahren in vivo in einer Ratte, in vitro an frisch isolierten Ratten Inseln und in vitro an eukaryontischen Zelllinien durchgeführt (vgl. Abb. 7). Phage-display-Bibliothek Isolierung gebundener Phagen Amplifizierung isolierter Phagen Sequenzierung von selektiven

Klonen nach der 5. Selektions-Runde in vitro Selektion an isolierten Inseln/Beta-Zelllinie in vivo Selektion in Ratten

Abbildung 7: Schematische Darstellung des Phage-disply Screenings.

Schematische Darstellung des in der Arbeit verwendeten Phage-Display Screening. Die Phagen-Bibliothek wird in vivo dem Versuchstier injiziert, in vitro an frisch isolierten Inseln, in vitro an eukaryontischen Zellen selektiert. Die gebundenen Phagen werden isoliert und amplifiziert. Phagen der 5. Selektionsrunde werden anschließend sequenziert und analysiert (modifiziert nach O´ Brien et al., 2002).

1.7 Bestimmung der CDRs (nach Kabat et al., 1987)

Die H-Kette und die L-Kette von Antikörpern bestehen jeweils aus einem konstanten FC-Teil und einer variablen Domäne. Die variable Domäne VH und VL weisen drei

(22)

Eigenschaften ihrer Aminosäureresten bestimmt wird. Die hypervariablen Regionen bestimmen die Antikörperspezifität und werden deshalb auch CDR genannt. Die Bestimmung der CDRs in den variablen Domänen der schweren und leichten Kette nach Kabat et al. (1987) werden durch folgende Regeln bestimmt:

Die CDR-H1 ist 10-12 Aminosäuren (AS) lang und startet direkt nach der AS-Abfolge C-X-X-X und im Anschluss an die CDR-H1 erfolgt ein W.

Die CDR-H2 beginnt mit 15 AS nach dem Ende der CDR-H1 und ist 16-19 AS lang. Ihr ist häufig eine L-E-W-I-G Sequenz vorgelagert. Diese Sequenz kann aber auch variieren (K/R-L/I/VF/T/A-T/S/I/A).

Die CDR-H3 beginnt 33 AS nach dem Ende der CDR-H2 und ist 3-25 AS lang. Sie startet meist 2 AS nach dem C. Der CDR-H3 ist eine C-X-X-Sequenz vorgelagert, meist eine C-A-R- Aminosäuresequenz. Im Anschluss an die CDR-H3 folgt immer eine W-G-X-G Aminosäuresequenz.

Die CDR-L1 beginnt immer nach der 24. AS meistens nach einem C und ist 10-17 AS lang. Im Anschluss befindet sich eine W-Y-Q, W-L-Q oder W-Y-L Aminosäuresequenz.

Die CDR-L2 ist 7 AS lang und beginnt immer 16 AS nach dem Ende der CDR-L1. Meistens ist der CDR-L2 eine I-Y, V-Y, I-K oder I-F Aminosäuresequenz vorgelagert.

Die CDR-L3 ist 7-11 AS lang und startet 33 AS nach dem Ende der CDR-L2 nach einem C. Im Anschluss an die CDR-L3 folgt meistens eine F-G-X-G Aminosäuresequenz.

1.8 Zielsetzung

(23)

a. In vitro Evaluation der generierten SCAs mittels eines radioaktiven Screening Assays, um die in vivo Potenz der Antikörper zu antizipieren. Die folgenden Parameter sollen dabei evaluiert werden:

- Spezifität (endokrin vs. exokrin) - Bindungsaffinität

- Bindungsstellen/Zelle - Bindungskinetik

b. Charakterisierung der individuellen SCAs in vivo (intrapankretische Spezifität). - Spezifität (exokrin vs. endokrin)

- Oberfläche vs. Cytoplasma

- Beta-Zellen vs. umgebende endokrine Zellen

- Affinität zu extra-pankreatischen Organen (Leber, Milz, etc.)

c. Bestimmung der BZM ex vivo mittels [125I]-makierter SCAs und Korrelation mit Markern der Beta-Zellfunktion

- nicht-diabetische vs. diabetische Tiere

(24)

2 Material und Methoden

2.1 Material 2.1.1 Chemikalien

Aceton Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Agar AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Albumin (Fraktion V) AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Aprotinin AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Chloramin-T Trihydrat ACROS (Geel, Belgien)

Chloroform Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Chloroquin Diphosphat Sigma (München, Deutschland)

Collagenase NB4 Serva (Heidelberg, Deutschland)

Collagenase NB8 Serva (Heidelberg, Deutschland)

Coomassie® Brillantblau R-250 AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

DAPI AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Dimethylsulfoxid AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Dithizone Sigma (München, Deutschland)

Essigsäure Sigma (München, Deutschland)

Ethidiumbromid Lösung Sigma (München, Deutschland)

D(+)-Glukose wasserfrei AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Glycerin 87% AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Hefeextrakt AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Imidazol AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Isopropyl β-D-thiogalactopyranosid Applichem (Darmstadt, Deutschland)

Leupeptin AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Methanol Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Natriumchlorid AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Natriumdodecylsulfat Applichem (Darmstadt, Deutschland)

Natriummetabisulfit Lancaster (Morecambe, England)

Nickel(II)-chlorid-Hexahydrat AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Osmium Chempur (Karlsruhe, Deutschland)

PBS (1x) PAA (Pasching, Österreich)

(25)

Phenylmethylsulfonyl Fuorid Roche (Mannheim, Deutschland) Polyethylenglycol 6000 Applichem (Darmstadt, Deutschland)

Roti®-Load 1 Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Rotiphorese®Gel Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Streptozotocin Sigma (München, Deutschland)

Trypton AppliChem (Darmstadt, Deutschland)

Tween 20 Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Xylol Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden von den Firmen AppliChem (Darmstadt, Deutschland), Sigma (München, Deutschland) und Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen und waren vom höchsten Reinigungsgrad.

2.1.2 Antibiotika

Ampicillin (AppliChem; Darmstadt, Deutschland) Stammlösung: 100 mg/ml

Gebrauchslösung: 100 µg/ml

Kanamycin (Sigma; München, Deutschland) Stammlösung: 30 mg/ml

Gebrauchslösung: 50µg/ml

Penicillin/Streptomycin (PAA; Paschingen, Österreich) Stammlösung: 100 x

Gebrauchslösung: 1x

2.1.3 Medien und Zusätze für die Zellkultur

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Medien und Zellkulturzusätze wie FCS, Trypsin EDTA, L-Glutamin 200 mM (100x), PBS, MEM Vitamine und nicht essentielle Aminosäuren wurden von der Firma PAA (Paschingen; Österreich) bezogen.

2.1.4 Verbrauchsmaterialien

(26)

2.1.5 Bakterien

E.coli TG1

K12 .(lac-proAB) supE thi hsdD5/F' traD36 proA+B lacIq lacZ .M15

E.coli HB2151

K12 ara .(lac-proAB) thi/F' proA+B lacIq lacZ .M15

BM25.8

supE44, thi ∆(lac–proAB) [F’ traD36, proAB+, lacIqZ ∆M15]λimm434 (kanR)P1 (camR) hsdR (rk12– mk12–)

XL1-Blue

endA1, gyrA96, hsdR17, lac –, recA1, relA1, supE44, thi-1,[F' lacI qZ ∆M15, proAB, Tn10]

2.1.6 SCA-Bibliothek

Tomlinson Bibliothek I; MRC Genservice (Cambridge, UK)

2.1.7 Zelllinien

AR42J (ATCC; Manassas, USA)

Ins 1 (Hr. C.B.Wollheim; Genv, Schweiz) AlphaTC1 (ATCC; Manassas,USA)

2.1.8 Versuchstiere

Für die Versuche wurden 6 Wochen alte weibliche CD-Ratten verwendet, welche von der Firma Charles River Laboratories bezogen wurden.

Alle Tierexperimente wurden im Rahmen der Tierversuchsgenehmigung (Nr. 50.10.32.08.037) vom Landesamt für Naturschutz Nordrhein-Westfalen

(27)

2.1.9 Humane Pankreasschnitte

Der Gebrauch humaner Pankreasschnitte, die von nicht-diabetischen Patienten, die sich einer partiellen Pankreatektomie unterziehen mussten, wurde von der Ethik-Komission der Ruhr-Universitär Bochum genehmigt (Nr. 2528, Ergänzung3).

2.1.10 Antikörper

Anti-Bakteriophage (monoklonal Kaninchen; Sigma; Missouri, USA)

Anti-Myc (monoklonal Maus; Cell Signaling/New England Biolab; Frankfurt) Anti-Insulin (polyklonal Meerschweinchen; Dako; Golstrup, Dänemark) Anti-Glukagon (monoklonal Maus; Affinity BioReagents; Golden, USA) Biotinylierter anti-Kaninchen IgG (Linaris; Wertheim)

Biotinylierter anti-Maus IgG (Linaris; Wertheim)

Cy™3-konjugierter Ziege-anti-Maus (Jackson Immunoresearch Laboratories; Suffolk, UK)

Cy™3-konjugierter Ziege-anti-Meerschweinchen (Jackson Immunoresearch Laboratories; Suffolk, UK)

Cy™2 conjugated Streptavidin (Jackson Immunoresearch Laboratories; Suffolk, UK) DAPI (4`,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)(Invitrogen; Karlsruhe)

2.1.11 Oligonukleotide

Die Synthese der verwendeten Oligonukleotide, im Weiteren als Primer bezeichnet, wurde bei der Firma Metabion (Martinsried, Deutschland) in Auftrag gegeben.

Für das Arbeiten mit der Tomlinson Bibliothek I wurden folgende Primer verwendet: PCR-Primer für die Selektion:

pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CA

LMB3 CAG GAA ACA GCT ATG AC

Sequenzierprimer:

pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CA

2.1.12 Reagenzsysteme

Pierce® BCATM Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology; Rockford, USA)

(28)

GenEluteTM Agarose Spin Column (Sigma-Aldrich; St.Louis, USA)

ProPurTMIMAC (Nunc/Thermo Fisher Scientific; Langenselbold, Deutschland) QIAquick®PCR Purification Kit (Qiagen; Hilden, Deutschland)

QIAprep Spin Miniprep Kit ( Qiagen; Hilden, Deutschland)

Slide-A-Lyzer® Dialysis Cassette 10,000 MWCO (Pierce Biotechnology; Rockford, USA)

2.1.13 Enzyme und Größenstandard

Die in der vorliegenden Arbeit verwendete Taq Polymerase wurde von der Firma Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) bezogen und der 1 kb DNA-Marker bzw. der Protein-Marker (Page ruler) von Fermentas (St.Leon Rot, Deutschland).

2.1.14 Radioaktivität

125Iod (Hartmann Analytic; Braunschweig, Deutschland) 124Iod (IBA®;Belgien)

2.1.15 Lösungen und Medien für das Arbeiten mit der Tomlinson-Bibliothek

Alle Lösungen und Medien wurden in demineralisiertem Wasser aus der Reinstwasseranlage Milli-Q Plus der Firma Millipore, soweit nicht anders angegeben, angesetzt. Nach dem Ansetzen wurden die Lösungen und Medien autoklaviert und, soweit nicht anders angegeben, bei RT gelagert.

H-top Agar 16 g/l Tryptone

10 g/l Hefeextrakt

5 g/l NaCl

7 g/l Bacto-Agar

PEG/NaCl 20% PEG

(29)

Trypsin 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 1 mM CaCl2 bei -20°C lagern TY (2x) 16 g/l Tryptone 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl

2xTY (1% Glukose) 16 g/l Tryptone

10 g/l Hefeextrakt

5 g/l NaCl

1% Glukose

2xTY (0,1% Glukose) 16 g/l Tryptone

10 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl 0,1% Glukose TYE 10 g/l Tryptone 5 g/l Hefeextrakt 8 g/l NaCl 15 g/l Bacto-Agar

TYE (1% Glukose) 10 g/l Tryptone

5 g/l Hefeextrakt 8 g/l NaCl 15 g/l Bacto-Agar

1% Glukose

2.1.16 Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese

TAE 50x 242 g/l Tris-Base

(30)

2.1.17 Puffer für die Histologie

Antigen Unmasking Solution (Vector Loboratories; Burlingame, USA) Aurion Blockierungslösung (Aurion; Wageningen , Niederlande)

Aurion BSA-c (Aurion; Wageningen , Niederlande)

Aurion R-Gent SE-EM; Silverenhancement (Aurion; Wageningen , Niederlande) Aurion Ultra Small Immuno Gold reagent (Aurion; Wageningen , Niederlande) Fluorescent Mounting Medium (Dako; Golstrup, Dänemark)

Durcupan (Sigma) Dithizon-Pufferlösung 300 mg Dithizon 1 ml 25% Ammoniak 9 ml A.dest Glutaraldehyd 25% 25% Glutaraldehyd/l PBS Osmiumtetroxid 1% 25 ml Kaliumdichromat-Lösung 5% 25 ml NaCl 3,4% 50 ml A.dest. pH 7,4

20 ml Osmium (Chempur, Karlsruhe)

Toluidinblau

Lösung A 19,1 g Borax (di-Natriumtetraborat)

(31)

Toluidinblau 1% 1 g Toluidinblau 200 ml Boraxpuffer bei 4°C lagern Inkubationslösung PBS 0,1-0,2% Aurion BSA-c 15 mM NaN3

2.1.18 Lösungen und Puffer für den Western-Blot

Alle Lösungen und Medien wurden in demineralisiertem Wasser aus der Reinstwasseranlage Milli-Q Plus der Firma Millipore, soweit nicht anders angegeben, angesetzt.

Annoden-Puffer (10x); pH 8,9 242,2 g/l Tris-Base

Coomassie 1 g Coomassi Blau

(32)

PBS-T PBS

0,1% Tween 20

Transfer-Puffer (10x) 58,1 g/l Tris-Base

29,3 g/l Glycine

4,0 g/l SDS

2.1.19 Medien für die Inselisolierung

Bicoll Separating Solution Biochrom (Berlin, Deutschland)) Hanks` Salt Solution with Ca&Mg Biochrom (Berlin, Deutschland) Hanks` Salt Solution without Ca&Mg Sigma (Steinheim, Deutschland)

HEPES-Puffer Biochrom (Berlin, Deutschland)

Lymphozyten-Separation-Medium (LSM 1077) PAA (Paschingen, Österreich)

Hanks+ 500 ml Hanks+ (10x) 25 mM HEPES 50 ml PenStrep (Gibco) ad. 5 l A.dest pH 7,4 Hanks- 500 ml Hanks- (10x) 25 mM HEPES 50 ml PenStrep ad. 5 l A.dest pH 7,4 2.1.20 Geräte Analysewaage BL600 (Sartotius) Biophotometer (Eppendorf)

Blott-Gel-Kammer (Hoefer Scientific Instruments) Casy® Cell Counter (Schärfe System)

CO2 Inkubator (Heraeus)

(33)

Dampfsterilisator Varioklav (Thermo Scientific) Einbettautomat Reichert Lynx (Leica)

Eismaschiene (Ziegra)

Elektrophorese Power Supply B6 (Biometra) Feinwaage RC210D (Sartorius)

Gelektrophoresekammer (EASY-CAST™) Hand-Fuss-Monitor LB 1043 B (Berthold) Kontrastierautomat EM Stain (Leica) Magnetrührer (IKA®Works, Inc.) Mastercycler Gradient (Eppendorf) Mikroskope

ZEISS 109 Transmissions-Elektronen-Mikroskop (Zeiss) ZEISS Axioplan Mikroskop (Zeiss)

ZEISS Axiovert 25 (Zeiss) Minishaker (IKA®Works, Inc.) PET (Invecon; Siemens)

Pipettierhilfe Pipetus® (Hirschmann)

Reinstwasseraufbereitungssystem MilliQ Plus (Millipore) Schüttelaparat/Inkubator 1000 (Heidolph)

Sterilbank (Heraeus) Thermocycler (Labtech) Trimmgerät EM Trim (Leica)

Ultramikrotom Ultra cut UCT (Leica) Wasserbad (Köttermann)

Western-Blot-Apparatur Semi-Phor™ (Hoefer Scientific Instruments) Gamma-Zähler (Packard Instrument company)

Zentrifugen

Biofuge (Heraeus)

GR2022 (Jouan)

(34)

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkultur

2.2.1.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellkulturen

Die Kultivierung der Zelllinien erfolgte bei 37°C und 5% CO2-Gehalt im Brutschrank.

Die Ins-1-Zelllinie wurde in RPMI-Kulturmedium, die AlphaTC1- und AR42J- Zelllinie wurden in DMEM-Kulturmedium (low glucose/high glucose) mit entsprechenden Zusätzen (vgl. Tabelle 1) kultiviert.

Tabelle 1: Medienzusammensetzung

Zusätze DMEM high glucose DMEM low glucose RPMI 1640

10% FCS √ √ √ Penecillin/Streptomycin √ √ √ MEM-Vitamine √ √ nicht essentielle Aminosäuren √ HEPES √ Glukose √ .

2.2.1.2 Kryokonservierung von eukaryontischen Zellen

Für eine längere Lagerung können Zelllinien in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Hierzu wurden Zellen aus einer 75 cm2 Zellkulturflasche mit 3 ml Trypsin EDTA abtrypsiniert, in 10 ml des entsprechenden Zellkulturmediums aufgenommen und zentrifugiert (1300 g; 5 min; RT). Das Zellpellet wurde in dem entsprechenden Zellkulturmedium mit Zusatz von 10% DMSO in flüssigem Stickstoff eingefroren.

2.2.1.3 Auftauen von eukaryontischen Zellen

(35)

2.2.1.4 Passagieren von eukaryotischen Zellen

Die Zellen wurden alle 2-5 Tage passagiert, wenn sie eine Konfluenz von 70-90% erreichten. Zum Passagieren von Zellen einer 75cm2 Zellkulturflasche wurde das Kulturmedium abgenommen, die Zellen mit angewärmtem PBS gewaschen und mit 3 ml EDTA/Trypsin abtrypsiniert. Die Zellsuspension wurde mit 10 ml des entsprechenden Kulturmediums aufgenommen und zentrifugiert (1300g; 5 min; RT). Das Zellpellet wurde in 10 ml Kulturmedium aufgenommen, 1 ml dieser Zellsuspension wurde in eine frische 75cm2 Zellkulturflasche überführt und mit 25 ml Kulturmedium aufgefüllt. Für Experimente mit den Zellen wurde das Zellpellet in einem 50 ml Reaktionsgefäß mit dem entsprechenden Kulturmedium aufgefüllt und über Nacht im Brutschrank inkubiert.

2.2.2 Isolierung Insel-spezifischer-Phagen Klone (ISPC) mittels Phage-display Technologie

Für die Isolierung Insel-spezifischer-Phagen-Klone (ISPC) wurde die humane SCA Bibliothek I von Tomlinson (MRC, Cambridge) eingesetzt. Das Arbeiten mit der Bibliothek erfolgte in Anlehnung an das vom Hersteller mitgelieferte Protokoll. Zunächst mussten die M13 Helferphagen und die Bibliothek I amplifiziert und getitert werden.

2.2.2.1 Herstellung und Titern des M13 Helferphagenstocks

5 ml 2xTY wurden mit TG1 Bakterien angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,4 bei

37°C und 140 g inkubiert. 200 µl dieser Bakterienkultur wurden mit 10 µl einer 100x seriellen Verdünnung des vorhandenen M13 Helfer-Phagen-Stocks infiziert und bei 37°C im Wasserbad für 30 min. inkubiert. Der Ansatz wurde mit 3 ml geschmolzenen H-top Agar (42°C) gemischt und auf eine angewärmte TYE-Agarplatte (ohne Antibiotika) gegeben. Es folgte eine Inkubation über Nacht bei 37°C. Ein kleiner Plaque wurde anschließend in 5 ml frischen TG1 Bakterien einer OD600 von 0,4 gepickt und 2 h

bei 37°C unter Schütteln inkubiert. 500 ml 2xTY wurden mit dieser Kultur in einem 2 l

(36)

Durch Zentrifugation (10.800 g; 15 min; 4°C) der Über-Nacht-Kultur wurden die Bakterien sedimentiert. Zu 400 ml phagenhaltigem Überstand wurden 100 ml PEG/NaCl geben und 1 h auf Eis inkubiert. Nach einer weiteren Zentrifugation (10.800 g; 30 min; 4°C) wurde das Pellet in 8 ml PBS resuspendiert, mit 2 ml PEG/NaCl versetzt und für 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation (3.300 g; 30 min; 4°C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet

wurde in 5 ml PBS resuspendiert. Nach einer erneuten Zentrifugation (11.600 g; 10 min; 4°C) wurde der phagenhaltige Überstand in ein neues

Reaktionsgefäß überführt.

Die Phagen wurden bis zu 4 Wochen bei 4°C gelagert und für eine längere Lagerung in PBS mit 15% Glycerin bei -80°C eingefroren.

Zur Titerbestimmung der Phagen wurden 45 µl Phagen mit 5 µl Trypsin Stammlösung gemischt und 30 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. 1 µl der Trypsin behandelten Phagen wurden mit 1 ml PBS versetzt und in fünf 100x seriellen Verdünnungen in 1 ml PBS angesetzt. 50 µl jeder Verdünnung wurden zu 1 ml TG1 Bakterien einer OD600 von

0,4 gegeben. Der Ansatz wurde mit 3 ml geschmolzenen H-Top Agar (42°C) gemischt und auf angewärmte TYE-Agarplatten (ohne Antibiotika) gegeben. Es folgte eine Inkubation über Nacht bei 37°C. Gleiches wurde mit nicht Trypsin behandelten Phagen durchgeführt. Der Titer der Trypsin behandelten Phagen sollte 105-108 pfu/ml geringer

sein als die nicht mit Trypsin behandelten Phagen. Der Titer der Helferphagen sollte mindestens 1012 pfu/ml betragen.

2.2.2.2 Amplifizierung und Titern der Phagenbibliothek I

200 ml 2xTY (100 µg/ml Ampicillin, 1% Glukose) wurden mit dem mitgelieferten Library Stock I angeimpft und bei 37°C und 220 g bis zu einer OD600 von 0,4 inkubiert.

50 ml dieser Kultur wurden mit 2x1011 M13 Helferphagen (vgl. 2.2.2.1) infiziert und 30 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach einer Zentrifugation (3.000 g; 10 min; 4°C) wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 100 ml 2xTY (100 µg/ml Ampicillin, 50 µg/ml Kanamycin, 0,1% Glukose) resuspendiert. Nach einer Inkubation über Nacht (220 g; 30 °C) wurde die Kultur zentrifugiert (3.300 g; 30 min; 4°C). 80 ml vom phagenhaltigen-Überstand wurden in ein neues Gefäß überführt, mit 20 ml

(37)

resuspendiert. Nach einer weiteren Zentrifugation (11.600 g; 10 min; 4°C) wurde der phagenhaltige-Überstand in ein neues Gefäß überführt.

Die Phagen wurden für eine kurze Lagerung bei 4°C und für längere Lagerung in PBS mit 15% Glycerol bei -80°C gelagert.

Zum Titern des Phagenstocks wurde 1 µl der Phagen in 100 µl PBS aufgenommen und von dieser Verdünnung aus wurden fünf 100x serielle Verdünnungen angesetzt. 900 µl TG1 einer OD600 von 0,4 wurden zu jeder Verdünnung geben und die

Bakterien-Phagen-Suspension wurde im Wasserbad bei 37°C für 30 min inkubiert. 10 µl jeder Verdünnung wurde auf eine TYE-Agarplatte (100 µg/ml Ampicillin, 1% Glukose) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die amplifizierte Phagenbibliothek I sollte 1012-1013pfu/ml betragen.

2.2.3 Selektionsverfahren

2.2.3.1 In vivo „Phage-display“

Die Ratte wurde mit 60 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital anesthesiert. Die Vena

jugularis wurde frei präpariert und über diese wurden dem Versuchtier 1012 pfu/ml

Phagen der Tomlinson Bibliothek I injiziert. Nach 5 minütiger Zirkulation wurde die Bauchdecke geöffnet und die Ratte mit 200 ml PBS über die Vena jugularis und der Aorta perfundiert. Das Pankreas wurde entnommen und die Inseln wurden isoliert (vgl. 2.2.7). Die frisch isolierten Inseln wurden in 1 ml Protease-Inhibitor-Cocktail und Cloroquine für 1 h bei 37°C und 220 g inkubiert. Nach einer Zentrifugation (3.300 g; 10 min.; 4°C) wurde der Überstand verworfen, das Pellet 2-mal in PBS gewaschen und anschließend in Tris/HCl gelöst. Nach Zugabe von 1 ml TG1 Bakterien

der OD600 von 0,4 wurde die Bakteriensuspension auf TYE Agarplatten

(38)

2.2.3.2 In vitro „Phage-Display“ (an isolierten Inseln)

Frisch isolierte Ratten-Inseln (vgl. 2.2.7) wurden mit 1 ml Protease-Inhibitor-Cocktailmix, Chloroquin und 1012 Phagen bei 220 g und 37°C für 1 h inkubiert. Nach einer Zentrifugation (3.300 g; 10 min.; 4°C) wurde der Überstand verworfen und das Pellet 2 mal mit 5 ml PBS gewaschen. Die Elution der Phagen erfolgte durch Zugabe von Tris/HCl. Nach Zugabe von 1 ml TG1 der OD600 von 0,4 wurde die

Bakteriensuspension auf TYE-Agarplatten (100 µg/ml Ampicillin, 1% Glukose) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Die entstandenen selektierten Phagenklone wurden amplifiziert (vgl. 2.2.4).

2.2.3.3 In vitro „Phage-Display“ (an eukaryontischen Zelllinien)

1x1012 pfu/ml Phagen wurden zu 1x106 frischen AR42J Zellen gegeben und bei 350 g und RT für 30 min inkubiert. Nach einer Zentrifugation (400 g; 5 min; RT) wurde der phagenhaltige Überstand auf 1x106 frische AR42J Zellen gegeben und erneut inkubiert

(350 g; 30 min; RT). Der phagenhaltige Überstand wurde nach einer erneuten Zentrifugation auf 1x106 frische Ins 1- Zellen gegeben und für weitere 2 h bei 350 g und RT inkubiert. Anschließend folgte eine Zentrifugation und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde 2 mal mit PBS gewaschen und die zellgebundenen Phagen wurden anschließend eluiert. Dazu wurden 0,5 ml PBS mit 100 mmol/l Zitronensäure (pH 2,2) zu der Zellsuspension gegeben und für 10 min inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation, der Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und mit 0,5 ml 1 mol/L Tris-HCl (pH 7,5) neutralisiert. TG1 Bakterien einer OD600 von 0,4

wurden anschließend mit den eluierten Phagen infiziert, auf TY-Agarplatten (100 µg/ml Ampicillin, 1% Glukose) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Entstandene Phagenklone wurden amplifiziert (vgl. 2.2.4).

2.2.4 Amplifizierung der selektierten Phagen

Die selektierten Phagenklone (vgl. 2.2.3.1- 2.2.3.3) wurden von den Agarplatten mit 3 ml TY (100 µg/ml Ampicillin, 1% Glukose) abgelöst und in einem 50 ml Reaktionsgefäß gesammelt. 50 ml 2xTY (100 µg/ml Ampicillin, 1% Glukose) wurden mit dieser Kultur angeimpft und bis zur OD600 von 0,4 bei 37°C und 220 g inkubiert.

(39)

30 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach einer Zentrifugation (3.300g; 10 min; 4°C) wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 50 ml 2xTY (100 µg/ml Ampicillin, 50 µg/ml Kanamycin, 0,1% Glukose) resuspendiert und über Nacht bei 30°C und 220 g inkubiert. Nach einer Zentrifugation (3.300 g; 15 min; 4°C) wurden 40 ml des Überstands mit 10 ml PEG/NaCl gemischt und 1 h auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation (3.300 g; 30 min; 4°C). Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 2 ml PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert (11.600 g; 10 min; 4°C). Der phagenhaltige Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. 1012 Phagen der selektierten, amplifizierten Phagen wurden in die nächste Selektionsrunde eingesetzt. Die verbleibende Phagensuspension wurde für bis zu 4 Wochen bei 4°C gelagert und für längere Zeit in 15% Glycerin bei -80°C.

Durch die Wiederholung der unter 2.2.3.1-2.2.3.3 und 2.2.4 beschriebenen Versuchsmethoden wurden 5 Selektions-Runden durchgeführt.

2.2.5 Proteinbiochemische Methoden

2.2.5.1 Expression löslicher SCA

Für die Expression löslicher SCA wurden 200 µl exponentiell wachsender HB2151 Bakterien (OD600 von 0,4) mit 10 µl Phagen von Interesse infiziert (30 min; 37°C;

Wasserbad). Ein Aliquot der infizierten HB2151 Bakterien wurde auf eine TYE-Agarplatte (100 µg/ml Ampicillin, 1% Glukose) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. 10 ml 2xTY (100 µg/ml Ampicillin, 0,1% Glukose) wurden mit einer Bakterienkolonie dieser Agarplatte angeimpft und über Nacht bei 37°C und 220 g inkubiert. 2 l 2xTY (100 µg/ml Ampicillin, 0,1% Glukose) wurden mit der Über-Nacht-Kultur angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,6 bei 37°C und 220 rmp inkubiert.

Durch Zugabe von 1 mM IPTG wurde die Proteinproduktion induziert (220 g; 4h; 30°C). Anschließend wurden die Bakterien mittels Zentrifugation (6.000 g; 15 min; 4°C) sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und das Bakterienpellet in die Präparation und Aufreinigung von SCA aus Bakterien eingesetzt (vgl. 2.2.5.2).

2.2.5.2 Präparation und Aufreinigung von SCA aus Bakterien

(40)

20 s gevortext. Nach einer Zentrifugation (11.600 g; 1h; 4°C) wurde der SCA-haltige Überstand steril filtriert (0,45 µm und 0,22 µm).

Aufgrund der sechs Histidinreste der SCA am N-Terminus der variablen Domäne der leichten Kette lassen sie sich über eine immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC) aufreinigen. Die Histidinreste bilden dabei Komplexe mit den Ni2+-Ionen. Die Komplexbildung kann anschließend durch einen Überschuss an Imidazol gelöst werden. Zunächst wurde die Säule mit 10 ml PBS equilibriert und anschließend wurde die SCA-haltige Suspension auf die Säule gegeben. Es wurde nachfolgend 6-mal mit PBS gewaschen, um ungebundene Proteine zu entfernen. Die Elution des SCA erfolgte mit 80 mM Imidazol. Der aufgereinigte SCA wurde über Nacht gegen PBS dialysiert und anschließend lyophilisiert. Nach Rehydration in A.dest erfolgte die Proteinbestimmung nach Bradford mit dem BCA-Assay Kit von PIERCE (vgl. 2.2.5.3). Die Reinheit des aufgereinigten und konzentrierten SCA wurde mittels eines SDS-Gels (vgl. 2.2.5.4) und anschließender Coomassie-Färbung (vgl. 2.2.5.5) überprüft. Des Weiteren wurde ein Westernblot (vgl. 2.2.5.6) durchgeführt.

Die aufgereinigten und lyophilisierten SCA wurden bis zu 6 Monate bei 4°C gelagert. Die in A.dest. resuspendierten SCA wurden bis zu 6 Wochen bei 4°C gelagert.

2.2.5.3 Proteinbestimmung nach Bradford

(41)

2.2.5.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die bei der SCA-Aufreinigung entstandenen Proteinfraktionen sowie die nach Dialyse und Aufkonzentrierung gewonnenen Proteinlösungen wurden in einem 12% igem SDS-Gel elektrophoretisch aufgetragen. Die Glasplatten für die SDS-Gelkammer wurden zunächst mit EtOH gereinigt. In einem Becherglas wurden nach Tabelle 2 die Bestandteile für ein Trenngel vermischt. Nach der Zugabe von APS (Ammoniumpersulfat) wurde die Acrylamidlösung zügig zwischen die Glasplatten gegossen. Nach dem das Trenngel auspolymerisiert war, wurden in einem Becherglas die Bestandteile des Sammelgels nach Tabelle 2 vermischt. Nach Zugabe von APS wurde die Lösung zügig auf das Trenngel gegossen und ein Kamm zum Auftragen der Proben in das Sammelgel gesteckt. Nachdem das Gel vollständig auspolymerisiert war, wurden die Glasplatten in die Elektrophorese Apparatur eingespannt und die Proben aufgetragen. Hierzu wurden 30 µl der Probe mit 10 µl Roti-Load gemischt und für 7.30 min bei 99 °C aufgekocht. Die aufgekochten Proben sowie ein Protein-Molekulargewichtsmarker wurden auf das SDS-Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von 50 Volt für 2-3 h durchgeführt.

Tabelle 2: Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel

Zusatz 12 % Trenn-Gel Sammel-Gel

A.dest. 5,3 ml 6,25 ml

Gel-Puffer (ohne Glycerol) 6,7 ml 2,5 ml

30% Acrylamide 8 ml 1,25 ml

Phenol rot 1 Tropfen 2 Tropfen

TEMED 50 µl 40 µl

10% APS 70µl 60µl

2.2.5.5 Nachweis der SCA-Aufreinigung mittels Coomassie-Brilliantblau-Färbung

(42)

2.2.5.6 Western-Blot

Nach der Elektrophorese (vgl. 2.2.5.4) wurde das Polyacrylamid Gel mit den aufgetrennten Proteinen aus der Elektrophorese Kammer genommen, das Sammelgel abgeschnitten und für 1 h in Transferpuffer equilibriert. Anschließend wurden vier in Gel-Größe zugeschnittene Whatmann-Filterpapiere und eine Nitrocellulosemembran in Transferpuffer getränkt. Der Blot wurde wie folgt luftblasenfrei zusammengesetzt: Auf die untere Elektrode (Kathode) der Blot-Apparatur wurden zwei Whatmann-Filterpapiere gelegt, anschließend die Nitrocellulosemembran, das SDS-Gel und zwei Whatmann-Filterpapiere. Der Deckel (Annode) der Blot-Apparatur wurde anschließend aufgelegt, befestigt und mit einem Gewicht beschwert. Der Transfer erfolgte bei 10 Volt für 5 h.

Anschließend wurde die Membran in A.dest. gespült und nachfolgend in NTBPF 1 h geblockt. Der Primärantikörper anti-myc wurde 1:200 in NTBPF verdünnt und ü.N. bei 4°C unter leichtem Schwenken inkubiert. Nach 1 maligem spülen in A.dest. und weiteren 3x in PBS-T wurde der Sekundärantikörper anti-Maus 1:20 in NTBPF verdünnt und 1 h bei RT inkubiert. Nach 3x 10 min Waschen mit PBS-T wurde das ECL Reagenz nach Angaben des Herstellers auf die Membran gegeben und der Blot ausgewertet.

2.2.6 Molekularbiologische Methoden

2.2.6.1 Plasmidisolierung im analytischen Maßstab

Die Plasmid-Isolierung im analytischen Maßstab wurde mit dem QIAprep®Spin Miniprep-Kit von Qiagen durchgeführt. Zunächst wurde eine 3 ml über Nacht Kultur unter entsprechendem Selektionsdruck angezogen. Die nachfolgenden Schritte wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.2.6.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase-chain-reaction)

Die PCR diente der Amplifizierung von DNA in vivo. Der zu amplifizierende DNA-Bereich wurde durch zwei synthetischen Oligonucleotidprimern festgelegt.

(43)

1. Denaturierung 94°C 4:00 min 2. Denaturierung 94°C 0:30 min

3. Annealing 55°C 0:30 min

4. Elongation 72°C 2:00 min

30 Wiederholungen der Schritte 2.-4.

5. Elongation 72°C 3:00 min

Von den PCR-Produkten wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt (vgl. 2.2.6.3).

2.2.6.3 Agarose-Gelelektrophorese

Die DNA-Fragmente wurden nach ihrer Größe elektrophoretisch aufgetrennt. Die verwendeten 0,7% (w/v) Agarose-Gele wurden in 1x TAE-Puffer aufgekocht, mit 1/10 Vol. Ethidiumbromid (EtBr) versetzt und in eine Gelkammer, in die ein Kamm zum Auftragen der Proben gesteckt wurde, gegossen. Nach dem Erstarren der Agarose wurde das Gel mit 1x TAE überschichtet. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese mit 1/5 Vol. Ladepuffer versetzt. Als Größenstandard wurden 2,5 µl des 1 kb DNA-Leiter auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei einer Spannung von 90-120 V.

Nach der Elektrophorese wurde die DNA durch Bestrahlung von UV-Licht (λ=302 nm) sichtbar gemacht. Das Ergebnis der Elektrophorese wurde auf einem UV-Transsimulator analysiert und mittels einer Kamera festgehalten.

2.2.6.4 DNA-Extraktion aus Agarose-Gelen

(44)

2.2.6.5 Aufreinigung und Konzentrierung von DNA

Mittels des PCR-Purification Kit von Qiagen wurden die unter 2.2.6.4 aus dem Gel eluierte DNA-Suspension aufgereinigt und konzentriert. Hierzu wurde nach Angaben des vom Hersteller mitgelieferten Protokolls gearbeitet. Die Elution der DNA von der Säule erfolgte mit 30 µl sterilem A.dest..

2.2.6.6 DNA-Konzentrationsbestimmung

Für die DNA-Konzentrationsbestimmung wurde eine 1:100 Verdünnung der vorliegenden DNA hergestellt und in einer Quarzküvette die Absorption der DNA-Lösung bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Es gilt:

OD260 = 50 µg/ml dsDNA

Zusätzlich wurde die Absorption bei 280 nm gemessen. Der Quotient A260/A280 ist ein Maß für die Reinheit der Probe. Dieser Wert sollte zwischen 1,8-2,0 liegen.

2.2.6.7 Sequenzierung

Die Sequenzierungen wurden von der Firma GENterprise (Mainz) durchgeführt. Die Sequenzanalysen wurden mit dem Programm FinchTv durchgeführt und es erfolgte ein Sequenzabgleich der ermittelten Peptidsequenzen mittels BLAST (basic local

assignment search tool) des NCBI (National Center of Biotechnology Information).

2.2.7 Isolierung von Langerhans`schen Inseln der Ratte

Die Ratte wurde mit 60 mg/kg Körpergewicht Pentobarbital anästhesiert. Die Bauchdecke wurde geöffnet und entlang des Duodenums das distale Ende des Ductus

coledochus aufgesucht und nahe der Darmwand mit einem dünnen Faden abgebunden.

(45)

Das Organ wurde in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt und für insgesamt 14 min im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Dazu wurde nach 7 min Inkubation das Reaktionsgefäß 5x15 s gevortext. Zum Schluss wurde es kräftig geschüttelt. Die Zellsuspension wurde in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführt und auf 50 ml mit Hanks- aufgefüllt. Nach einer Zentrifugation (1200 g; 3 min; RT) wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und die Probe erneut auf 50 ml mit Hanks- aufgefüllt und gut gemischt. Nach einer weiteren Zentrifugation (900 g; 3 min; RT) wurde der Überstand abgenommen, die Probe auf 20 ml mit Hanks- aufgefüllt und in ein mit NaCl gespültes Filternetz gegeben. Der

Durchfluss wurde auf 50 ml mit Hanks- aufgefüllt und erneut zentrifugiert (900 g; 3 min; RT). Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet in 10 ml 1,09 Ficoll

resuspendiert und ein Dichtegradient aufgebaut. Dazu wurden 10 ml 1,077 Ficoll auf die Zellsupension gegeben und anschließend 5 ml Ficoll/Hanks- Gemisch (1:1) hinzugegeben. Es folgte eine Zentrifugation (2700 g; 11 min; RT). Die Insel-haltige Bande wurde abgenommen und in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Suspension wurde auf 50 ml mit Hanks- aufgefüllt und zentrifugiert (1200 g; 10 min; RT). Der Überstand wurde abgenommen und der Waschschritt wiederholt. Nachdem der Überstand abgenommen wurde, wurde das Pellet in 5 ml Hanks- aufgenommen und die Insel-Zahl bestimmt (durch Auszählen der Inseln unter dem Mikroskop).

2.2.8 Lokalisierung der ISPC und SCA

2.2.8.1 In vivo Lokalisierung der ISPC und SCA

Der Ratte wurden 1012 pfu/ml ISPC oder 100 µg SCA intravenös injiziert. Nach einer Zirkulation von 2 h wurde das Tier getötet, mit 200 ml PBS perfundiert, das Pankreas, die Kontrollorgane (Leber, Niere, Milz, Herz und Lunge) entnommen und über Nacht in Formalin fixiert. Es folgten immunhistochemische Färbungen der Gewebeproben (vgl. 2.2.8.2).

2.2.8.2 Immunhistochemische Färbungen an Paraffin-Schnitten

(46)

96% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH und A.dest.. Nachfolgend wurden sie in der Mikrowelle in AntigenDemascing solution für 10 min aufgekocht. Nach 45 min Abkühlung bei RT wurden die Schnitte in A.dest und PBS gespült. Unspezifische Bindungen wurden anschließend in PBS mit 2% BSA blockiert (1h; RT). Die primären und sekundären Antikörper wurden in PBS mit 2% BSA verdünnt. Die Detektion der Phagen bzw. SCA, Insulin und Glukagon erfolgte mit spezifischen Antikörpern. Die Gewebeschnitte wurden mit dem Primärantikörper anti-Bakteriophage (1:200) bzw. anti-myc (1:200) über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach 2-mal Waschen in PBS-Puffer wurden die entsprechenden biotinylierten Antikörper anti-Kaninchen (1:200) bzw. anti-Maus (1:200) für 1 h bei RT auf den Gewebeschnitten belassen. Anschließend erfolgte nach 2-mal Waschen mit PBS-Puffer eine Inkubation mit einem Cy2-conjugiertem-Streptavidin (1:100) für 1 h bei RT. Für eine Doppelfärbung wurde nach 2-mal Waschen mit PBS-Puffer der Gewebeschnitt mit anti-Insulin (1:800) bzw. anti-Glukagon (1:200) für 1 h bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach erneutem Waschen der Schnitte mit PBS-Puffer wurden diese mit dem entsprechenden Sekundärantikörper, anti-Meerschweinchen (1:800) bzw. anti-Maus (1:200) für 30 min bei RT inkubiert. Eine Kerngegenfärbung erfolgte nach 2-mal Waschen in PBS-Puffer mit DAPI für 30 min bei RT. Die Gewebeschnitte wurden nach erneutem Waschen in PBS-Puffer mit FluoreszenceMounting Medium eingedeckelt und unter einem Zeiss Axioplan Mirkroskop ausgewertet.

2.2.8.3 Elektronenmikroskopie

Der Ratte wurden 100 µg SCA intravenös injiziert. Nach 2 stündiger Zirkulation wurde das Tier mit einer Dithizon-Pufferlösung perfundiert, um die Inseln nach Yoshinaga und Blank (1979) darzustellen. Das Tier wurde anschließend mit 200 ml PBS-Puffer (pH 7.4) perfundiert und mit einer 2,5% igen Glutaraldehydlösung fixiert. Das Pankreas wurde entnommen und für 40 min in 2,5% iger Glutaraldehydlösung nachfixiert. Die Inseln wurden anschließend manuell unter einer Stereolupe mit einer feinen Nadel isoliert. Die Gewebeproben wurden 3-mal für 20 min mit PBS (pH 7,2-7,4) inkubiert. Es folgte eine Dehydrierung der Gewebeproben:

(47)

1. 1% Osmium 45 min

2. PBS 5 min (3-mal)

3. 30% EtOH 5 min

4. 50% EtOH 5 min

5. 70% EtOH 15 min

6. 96% EtOH 15 min (3-mal)

7. Gemisch aus Propylenoxid und EtOH (1:1) 15 min

8. Propylenoxid 15 min

9. Propylenoxid mit Durcupan-Gebrauchslösung 60 min

Zum Schluss erfolgte eine Einbettung in Durcupan-Gebrauchslösung und die Gewebeblöcke wurden bei 80°C für 8 h ausgehärtet.

An Semischnitten (500 µm) wurden mittels Toluidinblau-Färbung “Orientierungsschnitte“ angefärbt. Dazu wurden die Semischnitte auf einer Heizplatte 3 min mit 1% Toluidinblau gefärbt und anschließend in A.dest. gewaschen und mit Entellan eingedeckelt.

An Ultraschnitten (80 µm) wurde die Silber-Gold Färbung durchgeführt. Verbleibende Aldehyd-Gruppen wurden mit 0,1% NaBH4 in PBS-Puffer (15-30 min) inaktiviert.

Nach 3-maligem Waschen in PBS für 5 min wurden die Gewebeschnitte in Aurion blocking solution inkubiert (60 min) und nachfolgend in Inkubations-Lösung 2-mal (5 min). Die Inkubation mit dem Primärantikörper anti-myc (1:100) in Inkubationslösung verdünnt, erfolgte über Nacht bei 4°C.

Nach 6-maligem Waschen in Inkubationslösung wurden die Gewebeschnitte 120 min in Goldlösung inkubiert. Hierzu wurde das Gold-Konjugat 1:50 in Inkubations-Lösung verdünnt. Nach 6-maligem Waschen in Inkubations-Lösung und 2-maligem Waschen in PBS wurden die Gewebeschnitte in 2% Glutaraldehyd für 15 min fixiert. Nach 4-maligem Waschen der Gewebeschnitte in A.dest. wurden diese mit Silverenhancement für 60 min beschichtet und nachfolgend mit Osmium nachfixiert. Nach 3-maligem Waschen der Schnitte in A.dest. (10 min) wurden die Gewebeschnitte entwässert und in Durcupan eingebettet.

(48)

2.2.9 Charakterisierung des Bindungsverhalten der ISPC und SCA 2.2.9.1 Zellbasierter Bindungs-Assay

Die Bindungsaffinität der isolierten ISPC wurde mit der BRAZIL-Methode von Giordano et al. (2001) evaluiert. Hierzu wurden Ins 1-, AlphaTC1- und AR42J-Zellen 12 h vor dem Versuch mit Trypsin/EDTA abtrypsiniert, in entsprechendem Kulturmedium aufgenommen und zentrifugiert (1300 g; 5 min; RT). Das Zellpellet wurde in entsprechendem Kulturmedium aufgenommen, in einem 50 ml Reaktionsgefäß belassen, damit die Zellen nicht anwachsen können und im Inkubator bei 37°C und 5% CO2-Gehalt kultiviert. Für den Versuch wurden 106 Zellen der entsprechenden Zelllinie

mit 109 pfu/ml des entsprechenden ISPC oder mit dem Kontrollphagen ohne Insert, für 4 h auf Eis unter leichtem Schwenken inkubiert. Die Phagen-Zell-Suspension wurde anschließend auf eine organische Phase (n-dodecane:bromo-dodecane 1:90,8 (v/v); d = 1,017 g/ml) gegeben, zentrifugiert (12.000 g; 10 s; RT) und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das Zellpellet mit den gebundenen Phagen wurde anschließend abgeschnitten und in 1 ml TG1 Bakterien der OD600 von 0,4 amplifiziert und auf

TY-Agarplatten (100 µg/ml Ampicillin; 1% Glukose) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

2.2.9.2 Chloramin-T Methode

(49)

2.2.9.3 In vitro Radioaktivitäts-Bindungs-Assay

Das Bindungsverhalten der SCA wurde nach Sweet et al. (2004) mit einem Radioaktivitäts-Assay untersucht. Zur Evaluierung der Spezifität der SCA wurden Ins1-, AR42J- und AlphaTC1-Zellen wie unter 2.2.1.4 beschrieben 12 h vor Versuchsbeginn kultiviert. Ein Aliquot (106 Zellen) entsprechender Zellen wurde mit

radioaktiv markiertem Antikörper (5 µg oder wie angegeben) für 15 min oder angegebene Zeitpunkte inkubiert. Die gebundenen SCA wurden mittels Zentrifugation (12.00 g; 10 s; RT) durch eine organische Phase (n-dodecane:bromo-dodecane 1:90,8 (v/v); d = 1,017 g/ml) von ungebundenen getrennt. Nach einem Einfrierschritt in flüssigem Stickstoff wurde das Zellpellet abgetrennt und die Zell-assoziierte-Radioaktivität (CAR) im Gamma Zähler gemessen. Die CAR der SCA wurde auf das spezifische mittlere Zellvolumen normiert (fl, Femto Liter), das mit dem CASY bestimmt wurde, und in cpm/Zelle angegeben.

Um die Spezifität der Bindung des SCA 1 und SCA 3 zu überprüfen, wurden Kompetitions-Tests durchgeführt: 1) radioaktiv-markierter SCA 1 wurde zu 106 Ins-1 bzw. der SCA 3 zu 106 Alpha-TC1 gegeben, 2) in einem weiteren Absatz erfolgte zunächst eine Präinkubation mit unmarkierten- SCA 1 oder SCA 3 (jeweils 20 µg) und anschließend die Inkubation mit markierten SCA 1 oder SCA 3.

2.2.9.4 Pharmakokinetik

Den Ratten wurden jeweils 100 µg radioaktiv-markierter SCA i.v. injiziert. Zu den Zeitpunkten 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 120 min und 360 min wurden jeweils 3 Ratten getötet und 200 µl Blut abgenommen. Die Radioaktivität in den Proben wurde im Gamma Zähler gemessen und als Prozent injizierter Dosis pro Gramm Blut (% ID/g) angegeben.

2.2.10 Diabetesinduktion

(50)

2.2.11 Biodistribution der SCA in vivo und Bestimmung der BZM

Radioaktiv-markierter SCA 1 (0,5 µCi, 100 µg) wurde diabetischen und nicht diabetischen Ratten injiziert. Das Pankreas wurde nach 2 h entnommen, gewogen und die Radioaktivität im Organ gemessen. Die Anreicherung der SCAs wurde als Prozent injizierter Dosis pro Gramm Gewebe angegeben und gegen den Hintergrund, der in der Glandula parotis bestimmt wurde, korrigiert. Die BZM des korrespondierenden Pankreas wurde morphometrisch nach folgender Formel bestimmt: Beta-Zell Fraktion BCF (%) = Insulin-positive Fläche/ganze Pankreas-Fläche; BZM pro Pankreas (mg) = BCF x Pankreas-Gewicht (mg).

2.2.12 Intraperitonealer Glukose Toleranztest (IPGTT)

Den Ratten wurde 12 h vor Versuchsbeginn das Futter entzogen. Nachdem bei den Ratten die Plasma-Glukose gemessen und eine Blutprobe entnommen wurde, erhielt jede Ratte 2 g pro kg Körpergewicht Glukose i.p. injiziert. Nach 30, 60 und 120 min wurde erneut die Plasma-Glukose gemessen und Blut entnommen. Zur Bestimmung der Insulin- und Glukagon-Werte in den Blutproben wurde anschließend ein Insulin- und Glukagon-ELISA durchgeführt.

2.2.13 Insulin-ELISA

Der Insulin-ELISA wurde nach Angaben des vom Hersteller mitgelieferten Protokolls durchgeführt.

2.2.14 Glukagon-ELISA

Der Glukagon-ELISA wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.2.15 Apoptose- und Viabilitäts-Test

1x106 Ins-1 oder Alpha-TC1- Zellen wurden über Nacht bei 5% CO2 und 37 °C im

Inkubator mit 5 µg oder 20 µg SCA 1 oder SCA 3 inkubiert.

Abbildung

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