Enzim moduláció

Enzim moduláció

Enzim inhibíció és kinetikája

Az enzim felületén:

Szubsztrátkötő-hely

Katalitikus domain = AKTIV CENTRUM Az aktivitást befolyásolhatják:

További kötőhelyek:

fémionok (ionos és kelát formában) modulátor molekulák (inhibítor, aktivátor) A fehérje kovalens módosítása:

foszforilezés glikozilálás proteolízis

lehetnek azonosak is

2

ENZIM MODULÁCIÓ

Modulátorok hatása

Inhibitorok: Aktivátorok:

csökkentik a növelik a

reakciósebességet reakciósebességet

v_i v_a

Az inhibíció mértéke: az aktiválás mértéke:

0 0

i i

v v

ε = v^{− 0}

0 a a

v v ε = v⁻

3

INHIBÍCIÓ

REVERZIBILIS IRREVERZIBILIS

eldöntése:

Vmax

EO

KONTROLL

+REVERZIBILIS INHIBITOR

+IRREVERZIBILIS INHIBITOR

E S ES E P

EI

+ ⇋ → +

⇃↾

S 2

K ES k

E S E P

EI

+ ←→ → +

↓

4

INHIBÍCIÓ

komplett, teljes Az enzim a kötődés hatására teljesen elveszti aktivitását.

„Lineáris” inhibíció

részleges inhibíció Az aktivitás csak csökken, egy része megmarad.

„Hiperbolikus” inhibíció → A DIXON féle linearizált kinetikai diagramok alakjából.

DIXON ábrázolás: 1/v – I (inhibitor koncentráció)

5

Irreverzibilis inhibitorok

Di-izopropyl-foszfofluoridát:

a sarin ideggáz prototípusa Irreverzibilisen inaktiválja az acetilkolinészterázt (Ser- proteázokat). A Ser195-hez kovalensen kötődik (az ak- tív centrumban)

Hasonlók: Malathion, ethyl parathion(szerves foszfát peszticidek)

6

1. Kompetitív inhibíció

Versengés S és I között az E aktív helyéért, vagy-vagy:

kölcsönös kizárás

I lehet:

szubsztrát analóg alternatív szubsztrát termék

1. MODELL: Klasszikus kompetitív inhibíció

Az I verseng S-sel ugyanazon aktív hely elfoglalásáért

S I

7

Kompetitív inhibíció

2. MODELL: sztérikus gátlás A

I S

I kötődése egy másik kötőhelyhez térbelileg gátolja S-nek az aktív helyhez kötését.

8

Kompetitív inhibíció

3. MODELL: sztérikus gátlás B

I és az S egy analóg része verseng egy közös kötő- helyért.

S I

E

9

4. MODELL: átlapolás

1 és 3 kötőhely köti az inhibitort, a 2 és 4 kötőhely pe- dig a szubsztrátot, de egymást kölcsönösen kizárják.

I S

1 2 3 4

Kompetitív inhibíció

10

Kompetitív inhibíció

5. MODELL:

I kötődése az enzimhez konfor- máció változást okoz az enzi- men és ez megakadályozza S- nek az aktív centrumhoz kötő- dését.

Ilyen a végtermék gátlás (feed back inhibíció) is.

S I S

S I I

11

A kompetitív inhibíció kinetikája

A klasszikus kompetitív inhibíció kinetikája:

ha k_app>0 akkor I alternatív szubsztrát

ha k_app=0 akkor I „dead end” kompetitív inhibitor

S 2

K k

ES

app i

k

E S E P

I K

EI E P

+ →← → + +

′

→ + վ

( )

s

K E S ES

= ⋅

( )

i

K E I EI

= ⋅

12

A kompetitív inhibíció kinetikája

Alternatív szubsztrát: az enzim az analóg szerkezetűmole- kulával is végrehajtja a reakciót→alternatív termék keletke- zik.

A csoportspecifikus és régióspecifikus enzimeknek értelem- szerűen több alternatív szubsztrátja van.

Példa: máj enzimek: alkohol dehidrogenáz, aldehid dehidro- genáz

E + S ' ←   → E + P'

13

A kompetitív inhibíció kinetikája

Analóg kinetikai levezetés:

a „minket érdeklő” reakcióse- besség:

anyagmérleg az enzimre:

S 2

K k

ES

app i

k

E S E P

I K

EI E P

+ ←→ → + +

′

→ + վ

( )

s

K E S ES

= ⋅

( )

i

K E I EI

= ⋅

V dP dt k (ES)2

= =

E0 = +E (ES) + (EI)

14

A kompetitív inhibíció kinetikája

Osszuk el a két egyenletet:

Helyettesítsük be:

15 2

o

V k (ES) E =E (ES) + (EI)

+ ( )

s

K E S ES

= ⋅ ^Ki=( )^{E IEI⋅}

2 s o

s I

k E S

V K

S I

E E E E

K K

=

+ + ² 1

s o

s I

S

V K

S I k E

K K

= + +

V

= k E

A kompetitív inhibíció kinetikája

A sebességet végül ebben az egyszerű formában írhatjuk fel:

vagy:

vagy:

max 1

s i

V S

V I

K S

K

=  

+ +

 

 

max s 1

i

V V S

K I S

K

=  

+ +

 

 

max i

I S

I

v ( S ) v

K ( I )

K ( S )

K

=  + +

 

16

17

A kompetitív inhibíció kinetikája

Figyeljük meg, hogy a két kinetikai paraméter (K_s, V_max) közül csak K_sválto- zott, látszólag csökkent az enzim affinitása a szubsztráthoz.

V_maxértéke nem változik, a K_mnövekszik

18

A kompetitív inhibíció kinetikája

A Lineweaver-Burk féle li- nearizált ábrázolásban az egyenes egyenlete:

1/V_maxértéke nem válto- zik (közös metszéspont), az 1/K_mcsökken. ▼.│ Így azonosítható a kompe- titív inhibíció!

S 1 K 1 I V

K V

1 V 1

I max

S max







 + +

=

19

A kompetitív inhibíció kinetikája

A Lineweaver-Burk féle li- nearizált egyenesekből másodlagos ábrázolással további információt kapha- tunk: a meredekségeket az inhibitor koncentráció függvényében ábrázolva a tengelymetszet megadja a K_I-t.

S S S

max I max I max

K I K K

tg 1

V K V K V

 

=  + = +

  I

α

Néhány számítás

A L-B egyenes meredeksége arányos az I koncentrációval.

Mekkora I duplázza meg az inhibitor nélküli L-B egyenes me- redekségét?

Azaz I=K_Iesetben lesz kétszeres a meredekség.

De ez nem jelent 50%-os inhibíciót!

v_i/v =0,5 kiszámítása: →

S max

S

max I

tg K 1 V

K I

2tg 1

V K

α α

= ⋅

 

=  + 

 

I I

2= 1 I K I K

 

+

 

 

=

20

Néhány számítás

Adott S-nél melyik az az I, amelyik 50%-os inhibíciót okoz?

1 0 5

1

S i I

S

I S

S

K I S

V K

, S

V

K S I K S

... . ... ... K

 

+ +

 

 

= =

+

 

=  + 

 

21

Kompetitív inhibíció

Alternatív szubsztrátok : hexokináz: glükóz, fruktóz

S-analógok: gyógyszerek:

22

Szulfonamidok (mikrobaellenes szerek) hatás- mechanizmusa:

Kompetitív inhibíció

23

COOH

CH2 CH2 COOH

COOH

CH

CH

COOH borostyánkõsav fumársav

S P I

COOH

CH2 COOH

malonsav

szukcinát-de- hidrogenáz

2H

Szukcinát-dehidrogenáz(1.3.99.1)

S = szukcinát I = fumarát K_i= 1,9.10^-3mmol/l

24

K S 1 I K V S V

i s max

+







 +

=

K S 1 P K V S V

P s max

+







 +

=

1

1 1max

2

S1 1

S2

V V S

K 1 S S

K

=  

+ +

 

 

2

2 2max

1

S2 2

S1

V V S

K 1 S S

K

=  

+ +

 

 

Analóg inhibíciók

kompetitív inhibíció: termék inhibíció:

alternatív, versengő szubsztrátok esetén:

25

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

26

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

Az inhibitor az enzimnek egy másik kötőhelyéhez kapcsolódik és nem befolyásolja a szubsztrát kötődését – nem változtatja meg az enzimnek a szubsztráthoz való affinitását.

Csak a rapid ekvilibrium körülményei között létezik, K_s=K_m.

27

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

28

K_s

kp

E + S ES E + P

+ +

I I

K_i K_s

EI + S ESI

K_i

K E.S ES

EI.S

ESI és K E.I EI

ES.I

s= = i= = ESI

V = kp(ES)

V

V

ES E ES EI ESI

max

= + + +

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

V V

ES E ES EI ESI

max

= + + +

V V

S K 1 S

K I K

S.I K K vagy

V V

S K 1 I

K S 1 I

K illetve

V = V 1

1 I K

S

K S

max

s

s i s i

max s

i i

max

i s

=

+ + +

=

 +

 

+  +

 



 +

 

 +

V V S

K S ahol V V 1 1 I

K

maxi s

maxi max

i

= + =

+ Az inhibitor a látszólagos V_maxértéket változtatja meg, K_s(illetve K_m) értékét nem befolyásolja.

29

V 1/V

0 1/S } ¹

Vmax 1

Vmaxi 1 I

Ki Vmax

=

+ K

V 1 I K

m

max i

+

 

 K V

m max

I V_max

V_maxi

I

K_m S

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

I

K I V

K V tg K

I max

m max

m +

= α

30

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

Példák:

Ugyanaz a megoldás: I = K_I Példák:

Kreatinkináz (2.7.3.2)

S= kreatin/ATP inhibitor: ADP K_i=2.10^-3 Fruktóz-bifoszfatáz (3.1.3.11)

S=Dfr-1,6biP inhibitor: AMP K_i=1,1.10^-4 Mekkora I duplázza meg a L-B

egyenes meredekségét?

Mekkora I okoz 50%-os inhibíciót? ^max

max

1

2 1

S

S I

tg K V

K I

tg V K

α α

= ⋅

 

=  + 

 

31

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

Példák:

H⁺ionok hatása a kimotripszin esetében. Itt az aktív cent- rumban egy proton akceptor hely van, amely inhibeálható nö- vekvőH⁺-ion koncentrációval.

(A L-B ábrázolás tiszta nemkompetitív inhibíciót mutat, azon- ban ne feledkezzünk meg arról, hogy a pH-nak hatása van a fehérje molekula más részeire is).

nehézfém molekulák (-SH reagensek) vagy cianidok.

Ezeknél azonban a hatás gyakran irreverzibilis.

32

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

33

Az almaszelet levegőn megbarnul: o-difenol-oxidáz, kate- chin-oxidáz: katechin→ o-kinon

ez tovább oxidálódik barna termékekké

(hasonló enzim: tirozináz tirozin→ melanin.)

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

34

A katechin-oxidáz kompetitív in- hibitora:

para-hidroxi-benzoésav (PHBA), ugyanoda kötődik, mint a kate- chin.

nem-kompetitív inhibitora: fenil- tiourea – ez egy rézionhoz kötő- dik, ami szükséges az enzimmű- ködéshez.

UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

I csak a már létrejött ES komplexhez kötődik.

35

UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

I csak a már létrejött ES komplexhez kötődik

V = kp(ES)

ESI K ES.I és ES K_s=E.S _i=

ESI ES E

ES V

V

max= + +

36

UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

Az unkompetitív I a KS és Vmax értékét ugyanolyan mérték- ben csökkenti

V V

S K 1 S

K SI K K

max

s

s s i

= + +

V V S

K S 1 I K

max s

i

=

+  +

 



S K 1 I

K S K 1 I V 1 V

i S i

max +







 +

⋅ +

=

mint a nemkomp.inh.

a kompetitív fordítottja, KScsökken

37

UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

1 V

K V

1 S

1

V 1 I

K

m

max max i

= +  +

 



V V 1

1 I K

S K 1 I

K S

max i

m

i

=

+ ⋅

 +

 

 +

V_max/2 V_maxi/2

V_max V_maxi

I

V V

1 I K

maxi max

i

= +

K K

1 I K

mi m

i

= + K_m V

S

I

nem inhibeált

1/S 1/V

I

I=0 K_m/V_max 1/V_max

1 1

V I K i V

i

max max

= +

−1+I K K

i m

1/K_m

38

4. KEVERT TÍPUSÚ INHIBÍCIÓ

A kevert inhibíció sémája a nem-kompetitív inhibícióra ha- sonlít,

de:

az I jelenléte módosítja S-nek ES-ről történő disszociációját.

39

KEVERT TÍPUSÚ INHIBÍCIÓ

A kevert típusú inhibíció kinetikájának levezetése megegye- zik a nem-kompetitívval, annyi eltéréssel, hogy az ESI hár- mas komplex koncentrációjának behelyettesítésénél bekerül azαtényező:

s max

s i s i

max s

i i

S K

V

S I S.I

V 1

K K K K

vagy kissé átalakítva:

V V S

I I

K 1 S 1

K K

α

α

=

+ + +

=    

+ + +

   

    ⁴⁰

KEVERT TÍPUSÚ INHIBÍCIÓ

Vagy ha a két kinetikai paraméter változását fejezzük ki:

( )

max

I I

s

I

1 S

V=V I I

1 1

K K

K S

1 I K α

α

 ⋅  

+ +

   

  ⋅   +

+

maxi max

I

V =V 1 1 I

αK

 

 + 

  ( )

I si s

I

1 I K =K K

1 I αK

 

 + 

 

⋅ +

41

KEVERT TÍPUSÚ INHIBÍCIÓ

V_max/2 V_maxi/2

V_max V_maxi

I

V V

1 I K

maxi max i

= +α Kmi

V

S

I

nem inhibeált

1/S 1/V I

I=0 1 1

V I K

i V

i

max max

= +

− +

+

 

 1

1 I K

K I

K i m

i α -1/K_m

K_{m -1/αK}

m K V

I K m

i max

1+

 



1 1

Vmax α

α

−



 



1+ I K V

αi max

42

KEVERT TÍPUSÚ INHIBÍCIÓ

A kevert típusú inhibícióból szinte mindegyik előbb tárgyalt levezethető a reakcióséma részeinek elhagyásával:

43

∝= ∞kompetitív

∝< 1unkompetitív

INHIBÍCIÓK ÖSSZEFOGLALÁSA

S és I kölcsönösen kizárják egymást az enzimről

KOMPETITÍV

S és I egymástól függetlenül kötődnek az enzimre

NEMKOMPETITÍV

mint az előző, de az I megváltoztatja az enzim affinitását

KEVERT TÍPUSÚ

I csak a S után kötődik UNKOMPETITÍV

44

K S 1 I K V S V

i s max

+







 +

= K S

. S K 1 I V 1

= V

s i

max +







 +

V V S

K S 1 I K

max s

i

=

+  +

 



V V 1

1 I K

S K 1 I

K S max

i m

i

=

+ ⋅

 +

 

 +

K 1 I K S 1 I K V S V

i i s max







 +α

+







+

=

(¹ _K^I ) ^S

K 1 I K

S K 1 I V 1

= V

I I s I max

+ +α







+

⋅

⋅







 +α

kompetitív nemkompetitív unkompetitív

kevert

INHIBICIÓK ÖSSZEFOGLALÁSA

45

INHIBÍCIÓK ÖSSZEFOGLALÁSA

A kinetikai paraméterek (vmax, Ks) meghatározásához nem szükséges az egyenletek linearizálása. Az inhibíció típusá- nak azonosításához viszont nagy segítséget nyújt:

46

−1 K_m

1/V

0 1/S

1/V

0 1/S 1/V

0 1/S 1/V

0 1/S

KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ KEVERT TÍPUSÚ INHIBÍCIÓ

− +

 

 1 K 1 I

m Ki

} ¹

Vmax K

V 1 I

K

m

max i

+

 



} ¹

Vmax 1

Vmaxi 1 I

Ki Vmax

=

+ K

V 1 I K

m

max i

+

 

 K

V

m

max K

V

m max

I

I

K V

m max 1

Vmaxi 1 I

Ki Vmax

= +

− +

 

 1 K 1 I

m Ki −1

K_m

}_V¹

max

I

−1 Km

− 1 α.Km

−

+

 



+

 

 1 I

K K 1 I K i

m i α

1 Vmax

α α⁻



 

 1 1 Vmax

K V 1 I

K

m

max i

+

 

 I

LINEWEAVER-BURK ÁBRÁZOLÁS

Hanes – Langmuir ábrázolás

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

S/V

0 S

S/V

0 S S/V

0 S

S/V

0 S

K V

m max K

V

m ap p m a x

-Kmapp -Km

KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

I

K V

m max

K V

m maxi

-Km

1 Vmaxi

1 Vmax

I

K V

m m a x

1 V_maxi 1 Vmaxi

-Kmapp

-Km

I

UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

I 1 V_maxi

1 V_max

K V

m max K

V mapp m axi

-Kmapp

-Km

( )

−Km −1 Vmax

α

KEVERT TÍPUSÚ INHIBÍCIÓ

EADIE- HOFSTEE ábrázolás

V K max mapp

V/S

V

V/S

V V/S

V V/S

V V

K

max m

Vmax

−1 Km

−1 Kmapp

I

KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

V K

m a x m

V K

maxi m

−1 K_m

Vmax

Vmaxi

V K

max m

−1 K_m

−1 Kmapp

Vmax

Vmaxi

I

UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ

KEVERT TÍPUSÚ INHIBÍCIÓ V

K

max m

V K

max mapp

Vmax

Vmaxi

−1 K_m

− 1 Kmapp

I

V a

maxa 1−



 



( )

− −



 V

K a 1

m ax m

Egy újabb linearizálás: DIXON

Az inhibíciós kinetikák vizsgálatához használható az 1/v - I (Dixon féle) ábrázolás is. Itt azonos S értékekhez tartozó sebesség értékeket vizsgálunk. Ha ezek egyenest adnak, akkor az inhibíció lineáris. Az egyenesek elhelyezkedése segít beazonosítani az inhibíció típusát és kinetikai kons- tansait.

50

SI K V

K S 1 K V

1 V

1

I max

S S max i

+



 



 +

= Kompetitív inhibíció:

S 1 K 1 I V

K V

1 V 1

I max

S max







 +

+

=

1/Vi

I



 



 + S 1 K V

1 S

max

S

=tgα S K V

K

I max

S

S=∞, tgα=0 -KI







+

S

I K

1 S K -

1/Vmax

51

L-B: Dixon:



 



 + +



 



 +

= S

1 K V I 1 K V

S 1 K V

1 m

max I max

m

i

1/V_i

I



 



 + S 1 K V

1 _m

max

S

S=∞

-K_I

I max

m

K V

S 1+K

I maxK V tgα 1 , S=∞ =

1/_Vmax 0

52

Nemkompetitív inhibíció:

L-B: Dixon:

m

I I

max max

I I

K 1 1

K K

1 1

V V S V

   

+ +

   

   

= +

1 V

1

V K I 1

V 1 K

max i max S

= +  + m

 



I 1/V S nő

1

V 1 K

max S + m



 



1 Vmax

tg 1

V K_{max i} α=

− +

 

 K 1 K

i S

m −Ki

S= ∞

L-B:

Unkompetitív inhibíció:

Dixon:

1 V

K V

1 S

1

V 1 I

K

m

max max i

= +  +

 



SZUBSZTRÁT INHIBÍCIÓ

A szubsztrátnak ahhoz, hogy termékképző átmeneti komplex jöjjön létre, két vagy több helyen kell, hogy az enzimhez kö- tődjék.

Sok S molekula esetén egy S molekula az egyik, a másik pe- dig egy másik kötőhelyhez kapcsolódik, így inaktív komple- xek jönnek létre (ez is reverzibilis inhibíció).

54

E

-OOC

CH₂ CH₂

-OOC

E

-OOC

HC CH

-OOC

Borostyánkősav Fumársav E

-OOCCH₂CH₂COO^-

-OOCCH₂CH₂COO^-

Normális kapcsolódás S-inhibíció

■Nagy S koncentrációnál egy S molekula olyan kötőhelyhez is kap- csolódhat az enzimen, amely nem az aktív centrum része, az ilyen kötődés NEMKOMPETITÍV (v. unkompetitiv) módon megakadályoz- za a normális S kötődést.

■Az enzim működéshez szükség lehet egy AKTIVÁTOR molekulára.

Ha ez kapcsolódni képes a szubsztráttal, sok S molekula "elvonja"

az enzimtől az aktivátort, így csökkentve annak tényleges aktivitását.

■Két (vagy több) szubsztrátos reakciók esetén az egyik szubsztrát feleslege lekötheti a másik szubsztrát kötőhelyeit, megakadályozva a szükséges második szubsztrát kapcsolódását, így inaktív komp- lexek jönnek létre.

■Nagy S koncentráció aspecifikus módon is gátolhatja a reakciót, például az ionerősség megnövekedése miatt.

SZUBSZTRÁT INHIBÍCIÓ

55

SZUBSZTRÁT INHIBÍCIÓ

56

b és c – a Ks disszociációs állandó megváltozását mérő faktorok egyszeres S kötés esetén,

a - kölcsönhatási együttható

Rendszerint mindegyik > 1

V Vmax

1 Vmax

Km/Vmax

S 1/S

1/V

SZUBSZTRÁT INHIBÍCIÓ

L-B ábrázolásban egy egyenes és egy hiperbola szuperpozíciója.

57

SZUBSZTRÁT INHIBÍCIÓ

A szubsztrát inhibíció értelmezhető az unkompetitív inhibíció egy speciális eseteként, amikor a szubsztrát viselkedik inhi- bitorként: eredeti: I helyett S:

A szubsztrát inhibícióra levezettük:

Látható az analógia, K_i= a*K_s

58

V V S

K S 1 I K

max s

i

=

+  +

 



i 2 s max

K S S K V S V

+ +

=

i 2 s max

S s max

K S S K V S K

* a

S S 1 K V 1 V

+ + + =

= +

SZUBSZTRÁT INHIBÍCIÓ

Kis szubsztrát koncentrációknál S/K_i→ 0, ekkor visszakapjuk a M-M alakot:

Nagy szubsztrát koncentrációknál K_sel- hanyagolható, így a reakciósebesség hi- perbolikusan csökken:

59 i max

K 1 S V 1 V

= +

i 2 s max

K S S K V S V

+ +

=

S K V S V

s

max +

=

SZUBSZTRÁT INHIBÍCIÓ

60 V

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

0 50 100 150 200 250 300

Vmax=0.9,Ks=50,Ki=10 V_max=0.9,Ks=50,K_i=50

Vmax=0.9,Ks=50,Ki=100 Szubsztrát koncentráció(mg/L)