Untersuchung der Tet-vermittelten DNA-Demethylierung mittels eines neuen

Im Dokument Synthese und Analyse von natürlichen DNA-Modifikationen zur Aufklärung des epigenetischen DNA-Metabolismus (Seite 123-140)

4.2.1 Einleitung

Wie im vorherigen Abschnitt 4.1 gezeigt wurde, bewirkt die ektopische Expression der katalytischen Domäne von mTet1 (GFP-mTet1CD) in HEK-293T-Zellen eine ausgeprägte DNA-Demethylierung, die sich sowohl durch passive Verdünnung der Oxidationsprodukte von 5mdC bei der Zellteilung als auch durch aktive Prozesse erklären lassen könnte (siehe 4.1.2, Abbildung 8).[84] Bei den aktiven Prozessen geht man bislang hauptsächlich von einer Tdg-vermittelten Basenexzisionsreparatur von 5fdC und 5cadC aus.[7, 9, 13, 84, 312] Da dieser Mechanismus allerdings die intermediäre Bildung abasischer Stellen beinhaltet, könnte dies bei globalen Demethylierungsereignissen über vermehrte Strangbrüche zu genomischer Instabilität führen. Aus diesem Grund sind die direkten CC-Bindungsbruchreaktionen von 5hmdC, 5fdC und insbesondere von 5cadC nachwievor eine attraktive Alternative.[3, 11-12, 76, 84,

331] Trotz der in Abschnitt 3.3[11] gefundenen decarboxylierenden Aktivität von mES-

Zellkernextrakten, fehlen entsprechende Nachweise, ob solche Reaktionen in vivo in einer beträchtlichen Menge auftreten und ob ein entsprechendes Enzym existiert. Im Hinblick auf diesen alternativen Mechanismus wird im nachfolgenden Abschnitt der Ursprung der globalen DNA-Demethylierung in HEK-293T-Zellen untersucht, die bei der Überexpression von GFP- mTet1CD beobachtet wurde (Abbildung 8).

Bisherige Erkenntnisse zum Thema des direkten CC-Bindungsbruchs

Wie in Abschnitt 3.3 und 3.4 gezeigt wurde, kann der direkte CC-Bindungsbruch der oxidierten Derivate von 5mdC über eine Thiol-vermittelte transiente Absättigung der C(5)=C(6)-Doppelbindung ablaufen. Dies ermöglicht dann die Dehydroxymethylierung von 5hmdC, die Deformylierung von 5fdC bzw. die Decarboxylierung von 5cadC. Über diesen Mechanismus kann die jeweilige Nukleobase unter Freisetzung von Formaldehyd, Ameisensäure respektive Kohlenstoffdioxid unter Eliminierung des Thiols wieder rearomatisieren (Schema 13).[11-12] Die Methylierung von dC zu 5mdC durch die Dnmts verläuft nach einem sehr ähnlichen Mechanismus, weswegen diese Enzyme ebenfalls als potentielle Kandidaten für die Rückreaktion, also die DNA-Demethylierung, angesehen wurden.[11-12, 309] Unter den in Abschnitt 3.4 beschriebenen chemisch-synthetischen Bedingungen, die eine entsprechende enzymatische Aktivität simulieren sollte, war die Decarboxylierung von 5cadC etwa 10mal effizienter als die Deformylierung von 5fdC und

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60mal effizienter als die Dehydroxymethylierung von 5hmdC.[11-12] Kürzlich konnte die

Gruppe von Klimasauskas zeigen, dass bakterielle Dnmts diese Reaktionen in vitro tatsächlich katalysieren können.[331] Allerdings waren die Enzyme nur in der Lage 5hmdC und

5cadC direkt in dC umzuwandeln, während dies für 5fdC nicht beobachtet werden konnte. Als Grund wurde angeführt, dass die aktiven Taschen der Dnmts für das Hydrat der Formylgruppe von 5fdC zu klein sind, welches für die Deformylierung unter Freisetzung von Ameisensäure benötigt wird (Schema 13). Im Gegensatz zu den bakteriellen Dnmts zeigten die orthologen Enzyme in der Maus und im Menschen (Dnmt1, Dnmt3a/3b) jedoch kaum eine Reaktivität, die durch physiologische Konzentrationen des Co-Faktors SAM sogar gänzlich verloren ging. Schlussfolgernd kommen die Dnmts von Säugetieren für die CC- Bindungsbruchreaktionen in vivo wahrscheinlich nicht in Frage.[331-332] Die Erkenntnisse zeigen aber zusammenfassend, dass verwandte Enzyme prinzipiell über diesen Thiol- vermittelten Mechanismus die CC-Bindungsbruchreaktionen der oxidierten Derivate bewerkstelligen könnten.

Schema 13 | Vorgeschlagene Mechanismen zum Thiol-vermittelten CC-Bindungsbruch von 5hmdC, 5fdC oder 5cadC z.B. durch DNA-Methyltransferasen.[11-12, 309, 331]

Ein stichhaltiger Hinweis für alternative Entfernungsmechanismen, wurde jüngst von der Gruppe von Guo-Liang Xu veröffentlicht. Die neue Studie lieferte Beweise, dass nach der Befruchtung der Eizelle das Genom durch Tet3 oxidiert wird, wobei neben der passiven

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Verdünnung der Oxidationsprodukte auch ein aktiver Entfernungsmechanismus vorhanden ist, der unabhängig von der Tdg-vermittelten Basenexzision ist. Als alternative Mechanismen könnten deshalb entweder andere Glykosylasen verantwortlich sein oder die bereits genannten CC-Bindungsbruchreaktionen in Frage kommen.[95] Naheliegend wäre, dass Tet-Enzyme möglicherweise selbst diese CC-Bindungsbruch-Reaktivität innehaben könnten. Dies wurde bisher noch nicht hinlänglich untersucht.[333] In Analogie zur Isoorotatdecarboxylase,[125, 253,

334] könnte ein ähnliches Enzym oder die Tet-Enzyme mit Hilfe eines aktivierten

Wassermoleküls den CC-Bindungsbruch bewerkstelligen (Schema 14A,B). Darüber hinaus wäre ein radikalischer Mechanismus denkbar, in dem das Hydrat von 5fdC oxidativ decarboxyliert wird (Schema 14C). Das aktive Zentrum der Tet-Enzyme würde für diese Reaktion im Gegensatz zu den Dnmts genügend Platz bieten.[128]

Schema 14 | Mögliche Thiol-unabhängige Mechanismen der CC-Bindungsbruchreaktionen. (A)

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nach Martynowski et al.[334-335] (B) Möglicher Mechanismus in Analogie zur Decarboxylierung von

5-Carboxyuracil (Isoorotat) durch die Isoorotatdecarboxylase nach Xu et al (Weg (i)).[125] Dieser

Mechanismus würde allerdings über die intermediäre Bildung eines hochenergetischen Vinylanions ablaufen (siehe Abschnitt 3.4).[12] Als Alternative könnte diese Reaktion auch nach Weg (ii) im Sinne

von Martynowski et al. ablaufen.[335] Bei diesem Mechanismus hätte der Stickstoff (N1) der

glykosidischen Bindung eine formal positive Ladung, wodurch als Begleitreaktion die Deglykosylierung der Nukleobase von der DNA eintreten könnte. M symbolisiert ein Übergangsmetallion (z.B. Zn oder Fe). (C) Alternativ könnte 5fdC durch Tet-Enzyme oxidativ decarboxyliert werden. Die Oxidation von 5fdC könnte chemisch gesehen eine vorhergehende Hydrat-Bildung voraussetzen.[6, 134] Nach H-

Abstraktion durch die Fe(IV)-Oxo-Spezies ist das sp3-Radikal des 5fdC-Hydrats durch

Nachbargruppeneffekte stabilisiert (allylische Doppelbindung und vicinale Sauerstoffatome). Dieses stabilisierte Radikal kann dann entweder zu 5cadC weiter oxidieren[8] oder könnte nach Enol/Keto-

Tautomerisierung oxidativ decarboxylieren. Auch bei diesem Mechanismus könnten durch radikalischen Zerfall abasische Stellen entstehen (siehe Abschnitt 4.3,Schema 16).

4.2.2 Ergebnisse und Diskussion

Entwicklung eines neuen Zellkern-basierten Assays

Für die Untersuchung möglicher CC-Bindungsbruchreaktionen in GFP-mTet1CD- transfizierten HEK-293T-Zellen wurde der in Abschnitt 3.3 erstmals vorgestellte Isotopenverfolgungs-Assay weiterentwickelt. Dieser beruhte auf der Inkubaton Isotopen- markierter 5cadC-enthaltender Oligodesoxynukleotide mit mES-Zellkernextrakten, anschließender Reisolation der DNA per Biotin/Streptavidin-Anreicherung und massen- spekrometrischer Analyse.[11] Abbildung 13 fasst den neuen Arbeitsablauf schematisch zusammen. Als Reportermoleküle wurden erneut Oligodesoxynukleotide synthetisiert, die [15N2]-markierte Derivate von 5fdC und 5cadC enthielten. Durch CC-Bindungsbruch-

reaktionen entstandenes [15N

2]-dC ist so von natürlichem dC aus der Zelle per

Massenspektrometrie zweifelsfrei unterscheidbar. Im Gegensatz zu der früheren Methode in Abschnitt 3.3[11] wurden intakte Zellkerne eingesetzt.[336] Moleküle mit einer Größe von bis zu 40 kDa und somit auch die synthetisierten Oligodesoxynukleotide können durch die Kernporen passiv diffundieren (Abbildung 13).[337-338] Dies bot zwei Vorteile: Zum einen befanden sich die Zellkerne nach ihrer Gewinnung in einem sehr nativen Zustand, d.h. der mögliche Verlust von essenziellen Cofaktoren oder die Denaturierung von Proteinkomplexen bei der Präparation von Zellkernextrakten konnte so minimiert werden. Zum anderen konnten die Zellkerne nach der Reaktion durch einfaches Zentrifugieren abgetrennt werden, während sich der Großteil der synthetischen Oligodesoxynukleotide im Überstand befand. Auf diese Weise konnte der Hauptteil der genomischen DNA in einem Schritt abgetrennt werden, die

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eine potenzielle StörquelleV für die spätere MS-Analytik der isotopenmarkierten

Oligodesoxynukleotide darstellt. Die Biotin/Streptavidin-Anreicherung aus Abschnitt 3.3[11]

war deshalb nicht notwendig.

Abbildung 13 | Schematischer Arbeitsablauf des neu-entwickelten Zellkern-Assays.

Synthetische Oligodesoxynukleotide, die [15N2]-markierte Cytosin-Derivate enthielten, wurden mit

HEK-293T-Zellkernen inkubiert, die mit GFP-mTet1CD überexprimiert waren.

Optimierung der ektopischen Expression von GFP-mTet1CD

Da GFP-mTet1CD möglicherweise direkt für die DNA-Demethylierung in HEK-Zellen per CC-Bindungsbruchreaktion verantwortlich sein könnte, wurde zunächst dessen Protein- konzentration durch Optimierung der Transfektions- und Expressionsbedingungen maximiert. Dabei bot das GFP-Fusionsprotein eine einfache Möglichkeit die Expressions- menge per Fluoreszenzmessung mit Hilfe eines Tecan-Readers und per FACS-Analyse zu kontrollieren. Abbildung 14 zeigt links eine konfokal-mikroskopische Aufnahme von HEK- 293T-Zellen mit einer maximalen Transfektionseffizienz von 75%. GFP-mTet1CD ist dabei hauptsächlich im Zellkern lokalisiert. Zusätzlich konnte die Expression durch eine

V Hohe Mengen genomischer DNA verursachen unter anderem durch die natürliche Isotopenverteilung (13C, 15N, 18O) eine Signalüberlagerung mit der [15N

2]-Isotopenmarkierung der synthetischen Oligodesoxynukleotide.

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Behandlung der transfizierten Zellen mit Natriumbutyrat vervierfacht werden. Mechanistisch wird diese Expressionszunahme durch Inhibierung von Histondeacetylasen erklärt.[339-340]

Unter diesen Bedingungen war GFP-mTet1CD auch im Zytosol in größeren Mengen vorhanden. Die Zellkernisolation wurde durch Zellaufschluss mit einem Dounce- Homogenisator und anschließender Zentrifugation bewerkstelligt. Typischerweise wird dies unter Verwendung einer Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette (Roche cOmplete, EDTA-frei) durchgeführt. Die Konzentration einer Tablette bezogen auf ein Puffervolumen von 40 mL darf hierbei nicht überschritten werden, da GFP-mTet1CD andernfalls irreversibel inhibiert wird. In Abbildung 14 sind rechts die erhaltenen Zellkerne zu sehen.

Abbildung 14 | Konfokalmikroskopie von HEK-293T-Zellen mit ektopischer Expression von GFP-mTet1CD. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mit Lichtkanal-Überlagerung. Links: Intakte

Zellen 36 h nach Transfektion mit einer Effizienz von 75% (FACS-Analyse); rechts: Zellkerne nach Isolation mit Hilfe eines Dounce-Homogenisators.

Probenaufreinigung

Wie bereits erwähnt, ermöglichte der Einsatz von intakten Zellkernen nach der Inkubation mit synthetischen Oligodesoxynukleotiden die einfache Abtrennung durch Zentrifugation (Abbildung 13). Nach der Abtrennung der Zellkerne wurde der Überstand dann schrittweise weiter aufgereinigt, um die Oligodesoxynukleotide in ausreichender Reinheit für die empfindliche massenspektrometrische Analyse zu erhalten. Zunächst wurden die dNTPs und NTPs mit Hilfe einer Phosphatase auf Nukleosid-Ebene hydrolysiert. Dies ist wichtig, da die Triphosphate bei der späteren alkoholischen DNA-Fällung co-präzipitieren und Reaktionspuffer von Tet-Enzymen viel ATP enthalten.[7, 330] Anschließend erfolgte eine Standard-Reinigung per RNase A- und Proteinase K-Verdau sowie Phenol/Chloroform- Extraktion und DNA-Präzipitation. Nach der DNA-Präzipitation befanden sich im DNA-

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Pellet noch Reste von genomischer DNA, da während dem Assay Zellkerne zum Teil platzen oder die Abtrennung per Zentrifugation nicht vollständig ist. Abbildung 15A zeigt die Analyse dieser Reinigungsstufe mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Der Assay wurde mit einem einzelsträngigen 13mer-Oligodesoxynukleotid durchgeführt, dessen Bande bei Inkubation mit 2 Millionen Zellkernen deutlich zu sehen ist. Bei Verwend- ung größerer Zellkernmengen (8 Millionen) und längeren Inkubationszeiten war an der Geltasche eine große Fraktion genomischer DNA zu erkennen. Zur Abtrennung dieser genomischen DNA wurde anschließend eine Filtration mit C18-Sep-Pak-Kartuschen

durchgeführt (Abbildung 13, Schritt 9). Molekulargewichtsfilter (cut-off-Filter) konnten nicht verwendet werden, da die synthetische DNA mit der genomischen DNA zurückgehalten wurde. Bei der Verwendung von 0.5 nmol eines einzelsträngigen Oligodesoxynukleotids (2 µg) und 46 Millionen Zellkernen (ca. 1218 µg genomische DNA) wurden mit diesem Protokoll nach massenspektrometrischer Quantifizierung 1020% der Oligodesoxynukleotide zurückgewonnen. Der Massenanteil von endogener DNA war dabei 2040%.

Optimierung der Tet-vermittelten Oxidationsreaktion

Um sicherzustellen, dass die Aktivität der transfizierten Zellkerne bei deren Präparation oder unter den Reaktionsbedingungen nicht verloren ging, wurde zunächst die Oxidationskraft des Fe(II)- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Tet-Enzyms innerhalb der Zellkerne untersucht und optimiert. Hierzu wurde ein kurzes 5mdC-enthaltendes einzelsträngiges Oligodesoxy- nukleotid mit der Sequenz 5′-GTA ATG XGG TAG G-3′ (X = 5mdC) gewählt, da kurze einzelsträngige Oligodesoxynukleotide durch Tet1CD in vitro mit hoher Effizienz oxidiert werden.[330] Die isolierten Zellkerne wurden zusammen mit dem Oligodesoxynukleotid und dem Tet-Reaktionspuffer (2-Oxoglutarat, Vitamin C, ATP, Hepes pH 7.9)[330] für 4 min auf Eis präinkubiert. Da Fe(II)-Lösungen durch Luftsauerstoff sehr schnell zu Fe(III) oxidieren, welches eine katalytisch inaktive Spezies darstellt, wurde Fe(II)-Sulfat erst zum Reaktionsstart zur Reaktionsmischung hinzugegeben. Ferner wurde der Reaktionspuffer und die Fe(II)- Lösung unter Sauerstoff-freier Atmosphäre (Schlenk-Bedingungen) hergestellt und bei 80 °C gelagert, um eine gleichbleibende Qualität für jeden Versuchstag zu gewährleisten. Zur Qualitätskontrolle wurden am Versuchtag gleiche Anteile der konzentrierten Lösungen von Fe(II)-Sulfat und des Reaktionspuffers (25x Stocklösungen) zusammengegeben. Pure Fe(II)- Gemische sind dabei zu Anfangs farblos. Luftsauerstoff bewirkt dann einen dunkelbraunen Farbumschlag, gefolgt von der Bildung eines dunkelgrünen Fe(III)-Niederschlags.

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Abbildung 15 | Stabilität und Reaktivität eines 5mdC-enthaltenden Oligodesoxynukleotids bei Inkubation mit HEK-293T-Zellkernen. (A) Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese

(20%iges Gel) von Zellkerninkubationen mit 5′-GTAATGXGGTAGG-3′ (X=5mC). Ohne C18-Sep-Pak-

Filtration (Schritt 9 in Abbildung 13) ist bei Verwendung höherer Mengen von Zellkernen und längeren Inkubationszeiten genomische DNA zu sehen. Das Oligodesoxynukleotid wird während der Inkubation in zum Teil per Exonukleaseaktivität abgebaut. (B) MALDI-TOF-Spektrum des isolierten Produkt- gemisches nach Inkubation von 1 nmol Oligodesoxynukleotid mit 15 Millionen Zellkernen für 60 min bei 37 °C und 300 rpm. Transfizierte HEK-Zellen wurden mit Natriumbutyrat zur Expressions- steigerung von GFP-mTet1CD behandelt. Neben einer deutlichen Oxidation von 5mdC zu 5hmdC ist eine Exonuklease-Aktivität von 3′5′ für den Abbau des Oligodesoxynukleotids verantwortlich. In der Tabelle sind die berechneten Molekülmassen aufgelistet. Diese entsprechen den Signalen des Spektrums mit einer akzeptablen Abweichung von 1 amu. Die mit (*) gekennzeichneten Massen

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entsprechen einer synthetischen Verunreinigung des eingesetzten Oligodesoxynukleotids. (C) MALDI- TOF-Spektrum des unbehandelten Oligodesoxynukleotids zum Vergleich. (D) LC-ESI-MS/MS-Quanti- fizierung der Nukleosid-Zusammensetzung nach enzymatischem DNA-Verdau des Reaktions- gemisches von (B). Dargestellt sind die technischen Mittelwerte ± Standardabweichung von Duplikats- messungen.

Die Reaktion der Zellkerne mit dem Oligodesoxynukleotid wurde durch Abkühlen auf Eis beendet. Die Kerne wurden anschließend abzentrifugiert und das eingesetzte Oligodesoxy- nukleotid, wie oben skizziert, aufgereinigt (Abbildung 13). In Abbildung 15B ist ein typisches MALDI-TOF-Spektrum des isolierten Produktgemisches nach 60 min Reaktionszeit zu sehen; Abbildung 15C zeigt das Spektrum des unbehandelten DNA-Stranges zum Vergleich. Rechts neben dem Edukt-Signal bei m/z 4065 wurde ein neues Signal bei m/z 4081 mit einer relativen Intensität von ca. 2/3 erhalten, welches der berechneten Molekülmasse (m/z 4082) des 5hmdC-enthaltenden Produktstranges entspricht. Daneben zeigen wiederkehrende Signalmuster im linken Teil des Spektrums den graduellen Abbau des Oligodesoxynukleotids während der Zellkerninkubation an. Der beobachtete Massenverlust jeweils eines Nukleotids entspricht einer Exonuklease-Aktivität, die das Oligodesoxy- nukleotid vom 3′-Ende zum 5′-Ende hydrolysiert. Bei 15 Millionen Zellkernen im Verhältnis zu 1 nmol Oligodesoxynukleotid, konnte in 60 min der partielle Verlust von vier endständigen Nukleotiden beobachtet werden. Aus quantitativer Sicht fiel jedoch nur der Abbau des ersten Nukleotids ins Gewicht (man vergleiche mit Abbildung 15A), weshalb die Stabilität des Oligodesoxynukleotids den Anforderungen genügte.

Das Produktgemisch der Oligodesoxynukleotide wurde anschließend enzymatisch verdaut und das erhaltene Nukleosidgemisch per UHPLC-ESI-MS/MS nach der in Abschnitt 3.4 beschriebenen Isotopenverdünnungsmethode exakt quantifiziert. Die LC-MS/MS-Ergebnisse der quantitativen Produktanalyse bestätigten die MALDI-TOF-Analyse: 5mdC und 5hmdC lagen in Anteilen von 59.5% bzw. 38.5% bezogen auf die Gesamtmenge modifizierter Cytidine vor (Abbildung 15D). Daneben konnte auch die Bildung von 5fdC und 5cadC mit je 1.6% und 0.4% festgestellt werden.

Der Umsatz von 5mdC konnte durch Verlängerung der Reaktionszeit und durch mechanische Rotationsbewegung des Gemisches bis auf ~60% gesteigert werden (Abbildung 16). Zusammenfassend konnte somit ein funktionsfähiger in vitro Oxidations-Assay unter Verwendung von Zellkernen von GFP-mTet1CD-transfizierten HEK-293T-Zellen etabliert werden.

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Abbildung 16 | Reaktionsoptimierung der Zellkern-basierten Oxidationsreaktion mit GFP- mTet1CD. LC-ESI-MS/MS-Ergebnisse der isolierten Produktgemische nach Inkubation von 500 pmol

Oligodesoxynukleotid (5′-GTA ATG XGG TAG G-3′; X=5mC) mit 6 Millionen Zellkernen bei 37 °C. Transfizierte HEK-Zellen wurden mit Natriumbutyrat zur Expressionsteigerung von GFP-mTet1CD behandelt. Dargestellt sind die technischen Mittelwerte ±Standardabweichung von Duplikats- messungen.

Analyse der DNA-Demethylierung per Isotopenverfolgung

Nach der Optimierung des Assays wurde die Analyse der DNA-Demethylierungsreaktionen per Isotopenverfolgung durchgeführt. Als Reportermoleküle kamen Oligodesoxynukleotide zum Einsatz, die [15N2]-markierte Derivate von X = 5mdC, 5fdC und 5cadC enthielten

(5′-GTA ATG XGG TAT G-3′). Durch CC-Bindungsbruchreaktionen entstandenes [15N2]-

dC ist per Massenspektrometrie von natürlichem dC aus der Zelle unterscheidbar. In Abschnitt 3.3 wurde für die Detektion von [15N2]-dC ein hochauflösendes Massenspektro-

meter (Orbitrap) verwendet, um die Unterscheidung von 13C-, 15N- oder 18O-Spezies der natürlichen Isotopenverteilung zu gewährleisten.[11] Da die verwendete LC-MS-Methode für eine Quantifizierung von [15N2]-dC nicht sensitiv genug war,[11] erfolgte die Analyse der

Reaktionsprodukte in diesem Abschnitt mit Hilfe eines Triple-Quadrupol-Tandemmassen- spektrometers (UHPLC-ESI-MS/MS). Die niedrigere Auflösung des Massenspektrometers war für dieses Experiment trotz eines Massenunterschieds von nur 2 amu durch die [15N2]-

Markierung geeignet, da die genomische DNA der Zellkerne ausreichend abgetrennt werden konnte (siehe oben). Ferner nahmen die [M+2]-Isotopologen des endogenen dCs bei Verwendung des MS-Übergangs m/z 230/114 in Kontrollproben nur einen Anteil von 0.3% ein.

Die LC-MS/MS-Quantifizierung der [15N

2]-markierten Reaktionsprodukte erfolgte durch

Zugabe von internen Standards mit einer höheren oder niedrigeren Isotopenmarkierung (siehe Experimentalteil). Abbildung 17 fasst die Ergebnisse der Isotopenverfolgungsexperimente

112 zusammen. Die Oxidation von [15N

2]-5mdC-enthaltenden Oligodesoxynukleotiden lieferte als

Hauptprodukt erneut [15N

2]-5hmdC. Abbildung 17A zeigt den direkten Vergleich der Tet-

vermittelten Oxidation von einzelsträngiger, hemi-methylierter und vollmethylierter doppelsträngiger DNA. Die Oxidation des hemi-methylierten Stranges war zwar relativ gesehen am stärksten, jedoch war die Anzahl an absoluten Oxidationsereignissen bei dem vollmethylierten Konstrukt am größten.

Abbildung 17 | Isotopenverfolgungsexperiment mit GFP-mTet1CD-Zellkernen. LC-ESI-MS/MS-

Ergebnisse der isolierten Produktgemische nach Inkubation von 350 pmol einzelsträngigen (ss) oder doppelsträngigen (ds) DNA-Konstrukten mit 4 Millionen Zellkernen bei 37 °C/600 rpm für 90 min. Transfizierte HEK-Zellen wurden mit Natriumbutyrat zur Expressionsteigerung von GFP-mTet1CD behandelt. ss-DNA: 5′-GTA ATG XGG TAT G-3′ mit X = [15N2]-5mC, [15N2]-5fC und [15N2]-5caC);

komplementäre DNA: 5′-CAT ACX GCA TTA C-3′ mit X = [15N2]-5mC und dC) (A) Quantifizierung der

Oxidationsprodukte nach Umsatz der jeweiligen DNA-Konstrukte. Der Modifikationsgehalt wurde auf 100% mit Ausnahme des vollmethylierten Doppelstranges (200%) normalisiert. Dargestellt sind technische Mittelwerte ± Standardabweichung von Duplikatsmessungen. (B) Quantifizierung der CC- Bindungsbruchreaktionen. Dargestellt ist die Differenz zwischen der Menge der [M+2]-dC-Isotopo- logen in HEK-293T-Zellen mit ektopischer Expression von GFP-mTet1CD und Wildtypzellen (WT). Fehlerbalken repräsentieren die Gaußsche Fehlerfortpflanzung der Standardabweichung aus je zwei technischen Replikaten.

[15N2]-5fdC-enthaltende Oligodesoxynukleotide wurden durch GFP-mTet1CD im Vergleich

113

berichteten Initialgeschwindigkeiten der Oxidationsreaktionen von mTet2CD, die in der Reihenfolge 5mdC >> 5hmdC > 5fdC abnehmen.[8] Auch bei [15N

2]-5fdC-enthaltenden

Oligodesoxynukleotiden war die Oxidation des hemi-modifizierten Doppelstranges deutlich ausgeprägter als die des Einzelstranges (Abbildung 17A). Zusammenfassend waren demnach die doppelsträngigen DNA-Konstrukte ein besseres Oxidationssubstrat für mTet1CD als die einzelsträngigen Konstrukte. Dies steht in Widerspruch zu den Ergebnissen von Kizaki und

Sugiyama, die in vitro eine höhere Reaktivität gegenüber Einzelsträngen berichteten.[330]

Obwohl eine hohe Oxidationsaktivität der Zellkernpräparation beobachtet werden konnte (bis zu ~75% 5mdC-Oxidation und ~50% 5fdC-Oxidation), war die Bildung von [15N2]-dC per

CC-Bindungsbruchreaktion durch GFP-mTet1CD nur im Spurenbereich (<0.1%) feststellbar (Abbildung 17B). Aus diesem Grund kommt die katalytische Domäne von Tet1 als Deformylase oder Decarboxylase unter den gegebenen Bedingungen nicht in Frage. In Wildtyp-Zellen konnte ebenfalls keine CC-Bindungsbruch-Reaktivität von [15N

2]-5fdC oder

-5cadC beobachtet werden, sowie keine sich anschließend ereignende, potenziell denkbare Remethylierung zu [15N2]-5mdC (Daten nicht gezeigt).

4.2.3 Zusammenfassung

In diesem Abschnitt wurde die Etablierung eines neuen Zellkern-basierten in vitro Assays vorgestellt. Dieser ermöglichte die Untersuchung von Oxidations- und CC-Bindungsbruch- reaktionen in GFP-mTet1CD-transfizierten HEK-293T-Zellen mit Hilfe von synthetischen Oligodesoxynukleotiden per Isotopenverfolgung. Während die Oxidation von 5mdC durch Tet1CD in hohen Ausbeuten beobachtet werden konnte, waren CC-Bindungsbruch- reaktionen höchstens im Spurenbereich präsent. Tet1CD hat übereinstimmend mit Tet2CD[8] eine Substratpräferenz für 5mdC, wobei doppelsträngige DNA mit höherer Effizienz oxidiert wird, als einzelsträngige DNA. Die Untersuchungen der katalytischen Domänen von Tet2 und Tet3 sowie der Volllängen-Enzyme stehen bezüglich der CC-Bindungsbruchreaktionen noch aus. In zukünftigen Arbeiten könnte der Assay generell für die Aktivitätsuntersuchung identifizierter DNA-bindender Proteine verwendet werden, um DNA-modifizierende oder DNA-reparierende Mechanismen in einer nativen Umgebung untersuchen zu können.[336, 338,

341]

4.2.4 Projektbeiträge in diesem Abschnitt

Unter enger Zusammenarbeit mit Olga Kotljarova, Edris Parsa, Benjamin Hackner und

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Entwicklung der Zellkerninkubation, die Etablierung des DNA-Isolationsprotokolls, die Aktivitätsoptimierung und die LC-MS-Analytik. Edris Parsa und Benjamin Hackner optimierten die Zellkultur- und Transfektionsbedingungen. Sie wurden durch Thomas

Wildenhof und Olga Kotljarova unterstützt. Olga Kotljarova und Benjamin Hackner führten

die Zellkernisolation durch. Arne S. Schröder und Barbara Steigenberger synthetisierten die modifizierten Oligodesoxynukleotide. Arne S. Schröder synthetisierte ferner [D3,15N2]-5mdC

als internen MS-Standard.

4.2.5 Materialien und Methoden

Zellkernpräparation

Intakte Zellkerne wurden nach einer geringfügig modifizierten Methode von Dignam et al. präpariert.[342-343] Das Zellpellet wurde mit einem fünffachen Volumen von Puffer A

resuspendiert, der 10 mM Hepes pH 7.9, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM frisches DTT

und eine EDTA-freie Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette (Roche cOmplete) enthielt. Eine Inhibitor-Tablette wurde in 40 mL Puffer gelöst. Die Zellsuspension wurde für 10 min auf Eis inkubiert, anschließend mit einer Eppendorf-Zentrifuge (5427 R) pelletiert (2000 rpm, 15 min) und erneut mit zweifachem Volumen von Puffer A resuspendiert. Die Zellen wurden

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