Semmelweis Egyetem, Orvos- és Gyógyszerésztudományi Diákköri Konferencia, 2012 áttekintõ programja
Az 1-es típusú angiotenzin receptor eloszlásának tanulmányozása élõ sejtekben
Szakadáti Gyöngyi SE ÁOK V.
szakadati.gyongyi@gmail.com
A plazmamembrán nem tekinthetõ homogén szerkezetû-nek, hanem specifikus lipid- és fehérje összetételû membrán-részletek, úgynevezett mikrodomének alkotják, melyeknek jelentõs szerepet tulajdonítanak különféle membrán folyama-tok elkülönítésében. Számos adat utal arra, hogy e mikro-doménekben a receptorok eloszlása nem egyenletes.
Kutatásaim során az 1-es típusú angiotenzin receptor (AT1R) eloszlását vizsgáltam a plazmamembrán különbözõ mikrodoménjeiben, illetve a receptor aktiválásának hatását erre az eloszlásra. A receptor mozgását biolumineszcencia energia transzfer, vagyis BRET technikával vizsgáltuk élõ, HEK293 sejtekben. A BRET mérésekhez az AT1R-t Renilla luciferázzal fuzionáltattuk, míg a különbözõ mikrodomén markereket, illetve egyéb fehérjéket fluoreszcensen jelöltük.
Korábbi kísérleteinkben kimutattuk, hogy az AT1R eloszlása eltérõ a plazmamembrán különbözõ mikrodoménjeiben, illet-ve stimulus hatására a receptor eloszlása megváltozik. Ago-nista hatására a receptor eltávolodott a mirisztoil és palmitoil csoporttal kihorgonyzott bioszenzortól (MP-YFP) és áthelye-zõdött a non-lipid raftokat jelzõ KR-YFP mikrodoménbe a re-ceptor internalizációját megelõzõen. Jelen kísérleteinkben ar-ra kerestünk választ, hogy a receptor mozgása milyen mecha-nizmussal történik. Kísérleteinkben a G fehérjét nem aktiváló mutáns (DRY/AAY-AT1) receptort, illetve a nem deszenziti-zálódó mutáns (TSTS/A) receptort vizsgáltuk és ezek mozgá-sait és tulajdonságait hasonlítottuk a vad típusú receptoréhoz.
Kimutattuk, hogy az AT1R mozgása a különbözõ mikro-domének között G-fehérjétõl nem független folyamat, illetve a receptor internalizációja gyorsabban megtörténik, ha stimu-lálása G-fehérje független módon történik HEK293 sejtek-ben. Ab-arrestin kötésre képtelen TSTS/A mutáns receptor aktivációt követõen áthelyezõdött a non-lipid raftokba, vala-mint a G fehérje függõ PtdIns(4,5)P2 hasításra is képes volt, azonban internalizációs képessége jelentõsen csökkent, me-lyet egy korai endoszóma markerrel (Rab5-YFP) vizsgáltuk.
Módszerünkkel az igen finom kinetikai különbséget is detek-tálni tudtuk a GRK2 és ab-arrestin kötõdés között a vad típu-sú receptor agonista kötõdése után. Kimutattuk továbbá, hogy a TSTS/A mutáns receptor – ellentétben a DRY/AAY-AT1 receptorral – képes kötni GRK2 fehérjét.
A kapott eredményeink alapján feltérképeztük az AT1R mozgásának mechanizmusát hormon stimuláció hatására.
A témavezetõ még nem publikált ebben a témában.
Témavezetõ(k): Prof. Hunyady László, egyetemi tanár, ni Intézet, Dr. Balla András, tudományos fõmunkatárs, Életta-ni Intézet
Az ATP-függõ P2X4 receptor csatornák gátlásának vizsgálata a citoplazmatikus Ca2+ -koncentráció nyomon követésén keresztül Rocskó Noémi Fanni SE ÁOK IV.
rocskonoemi@gmail.com
Bevezetés:Az ATP-függõ P2X4 purinerg receptor csator-nákon keresztül Na+és Ca2+áramlik a sejtekbe, mely hozzájá-rul a citoplazmatikus Ca2+koncentráció ([Ca2+]i) szabályozá-sához. A csatorna aktivitásának detektálására általában a patch clamp technikát használják, de már korábban is felme-rült alternatív módszerként a [Ca2+]i monitorozása, mely megkönnyítheti a receptorra ható szabályozó anyagok vizsgá-latát. Jelen munkánkban a P2X4 csatornák különbözõ specifi-citású gátlószereinek hatékonyságát vizsgáltuk mind elektro-fiziológiai, mind mikrofluorimetriás módszerek segítségével.
Arra is választ kerestünk, hogy a specifikus P2X4 antago-nistának leírt benzodiazepin származék 5-BDBD megtartja-e gátló hatását a P2X4 specifikus allosztérikus aktivátor iver-mectin jelenlétében.
Módszerek: A HEK-293 sejteket tranziensen transz-fektáltuk humán P2X4 fehérjét kódoló cDNS-sel, a fehérje expresszióját Western-blot analízissel ellenõriztük. A direkt ionáromok kimutatását patch clamp technikával, teljes-sejt konfigurációban végeztük. Az [Ca2+]i változásának mérésé-hez a sejteket Ca2+-szenzitív fluoreszcens festékkel (Fluo-3-AM; 4mM) jelöltük, majd a fluoreszcencia intenzitá-sának változását inverz konfokális mikroszkóp segítségével az egyes sejtek szintjén regisztráltuk.
Eredmények:A P2X4 fehérje transzfekcióját követõen a HEK-293 sejtekben az ATP befelé irányuló kation áramot in-dukált. Az áram amplitúdója az 5-BDBD koncentrációjának függvényében (0,5mM–20mM) csökkenthetõ volt. Az ATP a P2X4 fehérjével transzfektált sejtekben bifázisos Ca2+jelet indukált. A natív sejtekben, illetve a nominálisan Ca2+-mentes extracelluláris oldatban az ATP kizárólag tranziens választ okozott, igazolva, hogy a jel fenntartott része a P2X4-függõ Ca2+belépés eredménye. Az 5-BDBD (0,5mM–20mM) és a nem-specifikus gátlószerek (etanol; 50–200 mM illetve TNP-ATP; 0,5–50mM) koncentráció-függõ módon gátolták az ATP indukálta Ca2+jel fenntartott részének amplitúdóját.
Az ivermectin és ATP együttes alkalmazása szignifikánsan növelte a fenntartott Ca2+jel amplitúdóját. Az 5-BDBD csök-kentette az ivermectin serkentõ hatását.
Következtetések:Jelen eredményeink igazolják, hogy a [Ca2+]i változásának nyomon követése alkalmas a P2X4 re-ceptor csatornákon ható gátlószerek vizsgálatára. Az 5-BDBD potens gátlószere a P2X4 fehérjének, és ezt a hatását ivermectin jelenlétében is kifejti.
Dóra Hargitai, ..., Ákos Zsembery, et. al. Calcium entry is regulated by Zn2+ in relation to extracellular ionic environment in human airway epithelial cells. 2009.
Tamás Dankó, ..., Ákos Zsembery, et al. Extracellular alkalinization stimulates calcium-activated chloride conductance in cystic fi-brosis human airway epithelial cells. 2011.
Jelen elõadás a P2x4 receptor farmakológiai gátlószereinek jellemzésében haladja meg a publikációkat.
Témavezetõ(k): Dr. Zsembery Ákos, egyetemi adjunktus, Klini-kai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet, Dr. Dankó Ta-más, egyetemi tanársegéd, Klinikai Kísérleti Kutató- és Hu-mán Élettani Intézet
ÉLETTAN, KÓRÉLETTANII.
Orvos-,Fogorvos-ésGyógyszerésztudományiDiákköriKonferencia–2012
Endotélfunkció és artériás
baroreflex-érzékenység egészséges fiatalokban Cseh Domonkos SE ÁOK VI. – Sárközi Adrienn SE ÁOK V.
domonkos88@freemail.hu; sarkoziadrienn88@gmail.com
Elõzmények:Az endotélfunkció és a kardiovagális aktivi-tás (CVA) a rövid és hosszútávú kardiovaszkuláris szabályo-zás meghatározó tényezõi. A CVA domináns aktiváló beme-nete a kardiovagális baroreflex. Számos fiziológiai tényezõ hatására – mint edzettség vagy diurnális ritmus – az endotél-funkció és a baroreflex-érzékenység (BRS) párhuzamosan változik. Az életkor elõrehaladtával, valamint egyes kórálla-potokban, így hipertóniában, szívelégtelenségben, diabétesz-ben mindkettõ csökken. Ezen elõzmények alapján megvizs-gáltuk, hogy egészségesekben van-e összefüggés az endotél-funkció és a BRS között.
Alanyok és módszerek: 63 egészséges, fiatal (20,7±3,1 év) férfit vizsgáltunk. Az endotélfunkció jellemzésére meg-határoztuk az artéria brachialis áramlás indukálta vazo-dilatációját (FMD), amelyet a hiperémiás áramlásnövekedés mértékével normalizáltunk (nFMD). A BRS meghatározása spontán és 13 alany esetében farmakológiai módszerrel tör-tént. A spontán BRS szekvenciális (BRSseq) és spektrális (LFa) mutatóit 10 perces folyamatos, szimultán EKG- és vérnyomás-regisztrátumok együttes értékelése alapján hatá-roztuk meg. Az invazív farmakológiai módszer során a BRS-t aza1-adrenerg agonista fenilefrin intravénás bólus injekciója által indukált vérnyomás- és szívfrekvencia-változások alap-ján számoltuk, a szisztolés vérnyomás-RR-intervallum össze-függés meredekségeként (BRSphe).
Eredmények(átlag±SD): FMD – (6,79±2,72 %); nFMD – (36,66±13,48 %/cm/s); BRSseq – (20,10±8,36 ms/Hgmm);
LFa – (14,48±7,05 ms/Hgmm); BRSphe – (24,46±9,79 ms/Hgmm). Eredményeink a kornak megfelelõ normál tarto-mányba estek. Az endotélfunkciót jellemzõ paraméterek és a baroreflex-érzékenység mutatói között nem találtunk szigni-fikáns korrelációt.
Diszkusszió: Vizsgálatunkban az endotélfunkció és a kardiovagális baroreflex-érzékenység között nem volt kimu-tatható összefüggés. Feltételezhetõen a két rendszer párhuza-mos változásai és funkció-beszûkülése nem kölcsönhatásuk eredménye, hanem a különbözõ fiziológiai és patofiziológiai folyamatok egymástól függetlenül modulálják az endotélium és a baroreflex mûködését.
Az adott témakörben nincs korábbi publikációnk.
Témavezetõ(k): Dr. Pintér Alexandra, egyetemi tanársegéd, Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet, Dr. Hor-váth Tamás, egyetemi tanársegéd, Klinikai Kísérleti Kutató-és Humán Élettani Intézet
Kötõszövet szervezõdésének vizsgálata humán cerebralis aneurizmazsákok falában konfokális mikroszkópiával és numerikus képanalízissel Mihály Kornél SE ÁOK IV.
kornel.mihaly@gmail.com
Háttér:Az agyi aneurizmazsákok kötõszövete átrendezõ-dik a zsák falának lassú tágulása során. Laboratóriumunkban végzett biomechanikai vizsgálatok kimutatták, hogy a rostok iránya és rendezettsége alapvetõen meghatározza a zsák rupturajának helyét és idejét.
Célkitûzésünk:Olyan technikának kidolgozása, mely al-kalmas a rosthálózat geometriájának kvantitatív leírására.
Módszer:Hetven humán aneurizmazsákból készült szö-vettani metszeteken konfokális mikroszkóppal kötõszöveti autofluoreszcens képek kerültek fölvételre, lehetõvé téve a mikroszkóp lézerével floureszcens jelölõfesték nélkül is ger-jeszthetõ képletek megfigyelését. A sejtszegény területeken az extracelluláris mátrixban így látható alkotórészek kollagén és elasztin molekuláknak felelnek meg. A további pontos fel-dolgozás céljából az 1024´1024 képpontot tartalmazó képek (1 képpont = 0,14 µm) tömörítésmentes mentése vált szüksé-gessé, majd a képek transzformálása RGB mátrixszá az álta-lunk fejlesztett szoftver segítségével. A mátrix további feldol-gozása táblázatkezelõ alkalmazással folytatódott, kiolvasván a zöld szín intenzitását az eredeti képnek megfelelõen 10°-onként – a képet középpontja körül forgatva, majd a ka-pott adathalmazt autokorrelációnak vetettük alá, mely mód-szer alkalmas az adatokban eddig rejtve maradó ismétlõdõ tendenciák láthatóvá tételére, ezáltal pedig az általunk vizs-gált aneurizmafalak kvantitatív leírására.
Eredmények: Az elkészített autokorrelációs ábrákon megállapítható, hogy a falat alkotó kötõszövetes rétegeknek milyen jellegzetes ciklusa van, melybõl következtethetünk rendezettségük fokára is különbözõ irányokban. A legna-gyobb rendezettséget, mint az várható volt a zsák hosszabbik tengelyével a falra merõleges metszeteken lehetett azonosíta-ni. A sejtekben való elszegényedéssel a ciklusok periódusa nõ, a fal vékonyodásával viszont csökken. A sejtekben még gazdagabb rétegeknek a periodicitását a sejtek átlagos vastag-sága határozza meg.
Konklúzió:Modern konfokális autofluoreszcens techni-kákat képanalizáló matematikai módszerekkel kombinálva lehetõség nyílik az agyi aneurizmák már régebben leírt kötõ-szöveti rendezetlenségének kvantitatív leírására.
Laboratóriumunkban eddig döntõen biomechanikai kutatások folytak humán agyi aneurizmazsákokkal. Jelen elõadásom matematikai analízissel vizsgálja a témát, kutatócsoportunkon belül ez elõzmény nélküli.
Témavezetõ(k): Dr. Nádasy L. György, egyetemi docens, Klini-kai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet, Dr. Monos Emil, egyetemi tanár, Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet
Spermin hatásának vizsgálata az emberi feszültségfüggõ protoncsatornán Somogyi Katalin SE ÁOK IV.
somkatika@gmail.com
A mellékhere savanyú környezetében a tárolt spermiu-mok citoplazmatikus pH-ja 6 alatt van. Ejakulációt követõen a nõi genitális traktusban a spermiumok környezetének és ci-toplazmájának pH-ja lúgosodik. Ez a pH-változás elengedhe-tetlen a spermiumok különbözõ aktivációs folyamatainak be-indításához. Az intracelluláris (IC) pH emelkedésében fontos szerepet tulajdonítanak a Hv1 feszültségfüggõ protoncsator-nának, amely lúgos környezetben gyorsan eltávolíthatja a protonokat a savanyú IC térbõl.
Méréseinkbenaz ondóban magas koncentrációban jelen-lévõ spermin hatását vizsgáltuk a Hv1-re. A spermin egy tetrabázikus poliamin, melynek szabályozó szerepét több ion-csatorna esetén is leírták. A Hv1 N-terminális vége egy eddig tisztázatlan funkciójú polikarboxil régiót tartalmaz. Feltéte-lezzük, hogy a deprotonált karboxil csoportokhoz a kationos spermin kötõdhet, és így szabályozhatja a Hv1 mûködését.
A spermin hatását patch-clamp technikával vizsgáltuk humán eozinofil granulocitákon, mivel ezek a sejtek nagy mennyiségben tartalmazzák a feszültségfüggõ protoncsator-nát. Az extracellularis (EC) pH-t 7,5-re, az IC pH-t 7-re állí-tottuk be, melyek közelítõleg megfelelnek az ejakulátumban jellemzõ értékeknek. A feszültségfüggõ protonáram aktiváci-óját a plazmamembrán depolarizációjával idéztük elõ.
Elõkísérletekben ún. teljes sejt felállásban vizsgáltuk az EC adott spermin hatását (10 µM és 10 mM közötti koncentráci-ókkal), és megállapítottuk, hogy az EC spermin valószínûleg nem hat a csatorna mûködésére. Fõ kísérleteinkben ún.
inside-out patch technikával vizsgáltuk, hogy az IC spermin koncentráció változtatása (1 és 10 mM között), hogyan befo-lyásolja a csatorna mûködését. Ezen méréseinkben a 10 mM-os spermin koncentráció mintegy harmadára csökkentet-te a protonáramot. Megjegyzendõ azonban, hogy a gátláshoz szükséges spermin koncentráció meghaladja az ejakulátumra jellemzõ 1-3 mM-os EC spermin koncentrációt. Valószínût-len továbbá, hogy kialakulhat ilyen magas IC spermin kon-centráció a spermiumokban.
Eddigieredményeinkalapján tehát valószínûtlen, hogy az ejakulált spemiumok Hv1 csatornájának szabályozásában a magas spermin koncentráció fontos szerepet játszik. További kísérleteinkben ezért a mellékherére jellemzõ körülmények között, savanyúbb IC pH-án és szubmillimoláris spermin koncentrációk mellett kívánjuk tesztelni a Hv1 spermin általi szabályozásának lehetõségét.
Ebben a témában a munkacsoport még nem publikált.
Témavezetõ(k): Dr. Petheõ Gábor, egyetemi adjunktus, Életta-ni Intézet, Dr. Kovács István, PhD-hallgató, ÉlettaÉletta-ni Intézet
ÉLETTAN, KÓRÉLETTANII.
Orvos-,Fogorvos-ésGyógyszerésztudományiDiákköriKonferencia–2012
14-O-metilmorfin-6-szulfát: egy új, nagy hatékonyságú és hatáserõsségû, szelektív µ-opioid receptor agonista
Tóth Ágnes Anita SE ÁOK V.
tothagnesanita@gmail.com
Háttér:am-opioid receptor (MOR) agonisták, (pl. a mor-fin), hatékonyan csillapítják az akut és krónikus fájdalmakat, mellékhatásaik (légzésdepresszió, eufória és dependencia) azonban korlátozzák alkalmazásukat. Ismert, hogy a 6-szulfát (M6S) fájdalomcsillapító hatása hasonló a morfin-6-glukuronidhoz és erõsebb, mint a morfiné centrális adago-lás után.
Célkitûzés: Munkánk során az újonnan szintetizált 14-O-metilmorfin-6-szulfát (14-O-MeM6S) hatását vizsgál-tuk in vitro receptorkötési és G-protein aktivációs teszteken, valamint egér és patkány izolált vas deferensen (MVD és RVD) illetve a fájdalomcsillapító hatását mértük meg pat-kány tail-flick (RTF) teszten. Referens vegyületek – morfin, DAMGO, deltorfin-II, U69,593.
Módszerek: A receptorkötést és a G-protein aktivációt ([35S]GTPgS kötõdés) patkány és tengerimalac agyi memb-ránon mértük. MVD és RVD-n vizsgáltuk a vegyület hatásait a field stimulációval kiváltott simaizom kontrakcióra. Az antinociceptív hatást RTF teszten mértük.
Eredmények:A 14-O-MeM6S gátolta a specifikus ligan-dumok kötõdését: 1,1 nM [3H]DAMGO-val, 10,3 nM [3H]Ile5,6deltorfin II-vel (d-opioid receptor ligand) és 296 nM [3H]U69,593-val (k-opioid receptor ligand) szemben. A G-protein aktivációs teszten a 14-O-MeM6S Emax értéke ha-sonló volt a DAMGO-hoz és lényegesen meghaladta a morfin és a M6S értékét. MVD-n az 50%-os effektív koncentráció (EC50) a 4-O-MeM6S esetén 4,38 nM, a M6S esetén 107,19 nM, a morfin esetén 701,43 nM, míg a DAMGO esetén 238,47 nM volt. A naloxon disszociációs konstans értéke iga-zolta a 14-O-MeM6S agonista hatását am-opioid receptoro-kon. RVD-n (kevés MOR-t tartalmaz) a 14-O-MeM6S, ha-sonlóan a DAMGO-hoz, gátolta az izomkontrakciókat, míg a morfin és az M6S hatástalanok voltak. A RTF teszten a 14-O-MeM6S antinociceptiv hatása 48x illetve 32x volt na-gyobb, mint az M6S vagy a morfin ekvipotens adagja. A sc./icv. ID50 dózisok aránya 14-O-MeM6S és M6S esetén na-gyon magas volt.
Következtetés:Kísérleteinkben a metoxi csoport jelenléte a C14-en jelentõsen megnöveli az M6S hatékonyságát és intrinsic efficacy-ját. A magasabb sc./icv. arány a 14-O-MeM6S esetén a korlátozott vér-agy gáton való átjutás-ra utal. A nagy opioid aktivitású, agyba rosszul penetráló m-opioid receptor agonisták analgetikus hatásukat perifériás támadásponttal fejthetik ki, ez elõnyös lehet centrális mellék-hatásaik csökkentése szempontjából.
Korábban publikáció nem történt a témában, a téma egy része európai kongresszuson szerepelt.
Témavezetõ(k): Al-Khrasani Mahmoud, egyetemi adjunktus, Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet, Dr. Fürst Zsuzsan-na, kutatóprofesszor, Farmakológiai és Farmakoterápiás In-tézet
1-es típusú glicin transzporter (GlyT-1) gátlók hatása a hypoxia indukálta glicin felszabadulásra izolált patkány retinában
Hanuska Adrienn SE ÁOK VI.
kanyabangi@gmail.com
Bevezetés:A retinális ganglionsejtek kifejezetten érzéke-nyek hypoxiára. Ischaemia alatt a sejtekbe megnõ a Ca2+ be-áramlás NMDA receptorokon(NMDA-R) keresztül, ami apoptosishoz vezet. Az NMDA-R mûködéséhez szükséges koagonista a glicin(Gli). Célunk bebizonyítani, hogy hyp-oxiában a túlzott Gli kiáramlás gátlásának neuroprotektív ha-tása lehet.
Módszer:Patkányszembõl preparált hátsó szemserleget használtunk, amelyet belülrõl a retina szegélyez. A preparátu-mot 30 percig inkubáltuk oxigenizált Krebs oldatban és 1,25 µCi [3H]Gli jelenlétében 37 °C-on, majd 60 percig áramoltat-tuk át oxigenizált Krebs oldattal, 37 °C-on, hogy az aspeci-fikusan kötött [3H]Gli kimosódjon. Ezután frakciógyûjtést kezdtünk 3 percenként, különbözõ kísérleti körülmények kö-zött, hogy meghatározzuk a [3H]Gli felszabadulást. Az ered-ményeket, mint az átlag ± S.E.M. fejeztük ki, a statisztikai ér-tékeléshez az ANOVA-Dunnett tesztet alkalmaztuk, p a szignifikanciát, n a kísérletek számát jelöli.
Eredmények:Az amacrin sejtekbõl(AS) felszabadult Gli az inhibitoros Gli-receptorok aktivációjával és az AII AS-en, retinális ganglionsejteken levõ NMDA-R-okon befolyásolja a retina neuronhálózatát. Utóbbiért a GlyT-1 felelõs. Oxigén és glükóz mentes(OGD) pufferoldattal átáramoltatott prepa-rátumban a [3H]Gli felszabadulás megnövekedett (22,67±2,41 kBq/g n=8), az ischaemia alatt reverz módon mûködõ GlyT-1 miatt. OGD alatt csak a hátsó szemserlegbõl szabadult fel [3H]Gli, az elülsõbõl ezt nem tapasztaltuk. Az NFPS (nem transzportálódó GlyT-1 inhibitor), normoxiás kö-rülmények között nem változtatott a [3H]Gli felszabaduláson, de csökkentette annak mértékét OGD alatt (1,0 µM NFPS® 4,38±1,94k Bq/g[3H]Gli n=4). A nem szarkozin alapú GlyT-1 inhibitor Merck13-h és a GlyT-2 antagonista E-12533 vegyületek is csökkentették az OGD indukálta [3H]Gli fel-szabadulást (1,0 µM Merck13-h®2,03±0,15 kBq/g[3H]Gli;
1,0 µM E-12533 ® 1,71±0,46kBq/g[3H]Gli n=3 és 4). A [3H]Gli felszabadulás mértéke ANOVA-Dunnett teszttel vizsgálva (F(3,15)=20,47, p<0,001) mindhárom vegyülettel végzett kísérlet során szignifikánsan csökkent (p<0,01) a csak hypoxiában mérthez képest.
Következtetés:Ischaemia alatt a reverzen mûködõ GlyT-1 növeli a Gli felszabadulást, az NMDA-R aktivációt és az apoptosis beindulásához szükséges mechanizmusokat. A GlyT-1 és 2 gátlók a Gli felszabadulás csökkentésével neuro-protektív hatásúak lehetnek a retinadegeneráció folyamatá-ban.
Harsing LG Jr., Gacsalyi I, Szabo G, Schmidt E, Sziray N, Sebban C, Tesolin-Decros B, Matyus P, Egyed A, Spedding M, Levay G, Pharmacol. Biochem. Behav., 2003, 74, 811-825.
Harsing LG Jr., Juranyi Z, Gacsalyi I, Tapolcsanyi P, Czompa A, Matyus P: Curr. Med. Chem., 2006, 13, 1017-1044.
Harsing LG Jr., Albert M, Matyus P, Szenasi G: Exp. Eye Res., 2011, Nov 9.
A vizsgálat újdonsága a patkány retina használata preparátumként.
Témavezetõ(k): Dr. Hársing László Gábor, tudományos ta-nácsadó, Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet, Prof. Dr.
Mátyus Péter, egyetemi tanár, Szerves Vegytani Intézet
A foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát szerepének vizsgálata G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisában HEK 293 sejtben
Tallósy Bernadett SE ÁOK IV. – Hoffmann Péter SE ÁOK IV.
bernadett.tallosy@gmail.com; hoffmann.peter@citromail.hu
Számos irodalmi adat utal arra, hogy a foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát (PIP2) fontos szerepet játszhat plaz-mamembrán-fehérjék endocitózisának szabályozásában.
Munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy az 1-es típusú angiotenzin II receptor (AT1R) internalizációja PIP2 hiányá-ban jelentõsen gátlódik. Jelen munkánk során arra kerestük a választ, hogy a PIP2-depléció gátló hatása más G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisa esetén is megfigyelhetõ-e.
Az endocitózis követéséhez a molekuláris kölcsönhatás-ok kimutatására alkalmas Biolumineszcencia Rezonancia Energia Transzfer (BRET) módszert használtuk. Ehhez elké-szítettük a béta2 adrenerg receptor (b2R), illetve a 2-es típusú muszkarinerg acetil-kolin receptor (M2R) luciferázzal jelölt változatát. Bár több különbözõ konstrukcióval is próbálkoz-tunk, az M2R esetében nem sikerült megfelelõ mértékû sejten belüli expressziót elérnünk. A BRET-mérések során az akti-vált receptorok és a fluoreszcensen jelölt endocitózis mar-kerek (béta-arresztin 2, Rab5, plazmamembrán régiók) közöt-ti jelváltozásokat vizsgáltuk. A már korábban kidolgozott, a PIP2 akut depléciójára alkalmas, rapamicinnel indukálható rendszerrel (1) lecsökkentettük a plazmamembrán PIP2-szintjét, és vizsgáltuk ennek hatásait a receptorok internali-zációjára.
Méréseinkben sikerült nyomon követnünk a b2R endo-citózisának lépéseit: a receptor béta-arresztin 2 kötését, plaz-mamembrántól való eltávolodását, valamint a Rab5-tel jelölt korai endoszómába történõ megérkezését. A rapamicinnel létrehozott PIP2-szint csökkentés az AT1R-hoz hasonlóan a b2R esetében sem befolyásolta a béta-arresztin 2 kötést, el-lenben részlegesen gátolta a receptor plazmamembrántól való eltávolodását és megakadályozta megjelenését a korai endoszómában.
Eredményeink arra utalnak, hogy a plazmamembrán PIP2-depléció internalizációra gyakorolt hatásai nem specifi-kusak a Gq-receptorcsaládba tartozó fehérjékre, ezen hatáso-kat a Gs-fehérjét aktiváló b2R esetében is megfigyelhetjük.
1. P. Varnai, B. Thyagarajan, T. Rohacs, T. Balla (2006). Rapidly in-ducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact liv-ing cells. J Cell Biol. 175(3); 377-82.
Témavezetõ(k): Dr. Tóth Dániel, egyetemi tanársegéd, Életta-ni Intézet, Dr. Várnai Péter, egyetemi docens, ÉlettaÉletta-ni Intézet
A nociceptin és nocisztatin koronária hatásainak
A nociceptin és nocisztatin koronária hatásainak