VÍZTRANSZPORT SEBESSÉGE,
3.1.3. A szerves oldószerek hatása a Candida rugosa lipáz enzim aktivitására, enantioszelektivitására és stabilitására
3.1.3.1.Kapcsolat a Candida rugosa lipáz enzim aktivitása, enantioszelektivitása és a szerves oldószerek fizikai-kémiai tulajdonságai között
A szakirodalomban ellentmondó eredmények találhatók arról, hogy a Candida rugosa lipáz enzim aktivitása és enantioszelektivitása milyen módon függ az oldószerek fizikai-kémiai tulajdonságaitól. Ezek egy részében a különböző szerves oldószerekben tapasztalt eltérő enzimaktivitás és enantioszelektivitás nem tisztán az oldószerek hatását tükrözi. Ilyen eset például az, amikor igen eltérő polaritású oldószereket hasonlítanak össze vízaktivitás beállítás nélkül. Ezekben a kísérletekben valószínűleg az eltérő
vízaktivitás is közrejátszik az enzimaktivitás változásában. Előzetes kísérletekben a Candida rugosa lipáz enzim aktívnak bizonyult több ionos folyadékokban. Erre alapozva, az oldószerek hatásának vizsgálatába a hagyományos szerves oldószereken kívül ezeket az ionos folyadékokat is be kívántam vonni. A szerves oldószereket úgy választottam, hogy azok széles log P tartományt öleljenek át. A szakirodalomból az ionos folyadékok közül csak néhánynak a log P értéke volt ismeretes, ezért annak érdekében, hogy a log P skálán a [bmim]BF4, [bmim]PF6, és [omim]PF6 ionos folyadékokat is el lehessen helyezni, meg kellett határozni a megoszlási hányadosukat n-oktanol - víz kétfázisú rendszerben.
3.1.3.2. Vízaktivitás beállítás helyett víztartalom beállítás [5,15, 34, 55]
Az oldószereknek az enzim működésére gyakorolt valós hatásának tanulmányozása céljából a reakcióelegyekben azonos vízaktivitást szükséges biztosítani, hiszen csakis így kerülhető el a vízaktivitás különbségből eredő enzimaktivitás különbség. A megfelelő módszer kiválasztásakor azonban tekintetbe kell venni, hogy a [bmim]BF4 vízzel elegyedő poláros oldószer, amelynél a sóhidrátpárok és a telített sóoldatokkal történő vízaktivitás beállítás akadálya lehet, hogy a sók oldódnak az ionos folyadékokban [Eckstein, 2002]. E helyett azt a tényt használtam ki, hogy a Candida rugosa lipáz enzim aktivitása bármely oldószerben azonos vízaktivitás mellett maximális [Karr, 2003]. Az oldószerek polaritásának megfelelően ugyanaz a vízaktivitás eltérő víztartalom mellett alakul ki a különböző oldószerekben, vagyis eltérő víztartalom mellett lesz maximális az enzim aktivitását kifejező reakciósebesség vagy konverzió. A gondolatmenet megfordításából adódik a lehetőség: a kívánt optimális kezdeti vízaktivitás beállítható úgy, hogy megkeressük oldószerenként a maximális reakciósebességet biztosító kiindulási víztartalmat.
Természetesen egy adott vízaktivitás pontos beállításához végtelenül sok víztartalom mellett kellene mérni a reakciósebességet. E helyett minden oldószerben legalább öt különböző kiindulási vízkoncentrációt állítottam be. A reakciósebesség kiszámításához a 10%-os konverzióig vagy 5 h-n keresztül keletkezett (R)-, és (S)-2-klór-propionsav-butil-észterek mennyiségét vettem figyelembe. Annak érdekében, hogy az enantiomer arány kiszámításához szükséges egyensúlyi állandó meghatározható legyen, a reakciókat a gyorsan reagáló (R)-2-klór-propionsav-butil-észter egyensúlyi koncentrációjának eléréséig követtem nyomon szerves oldószerekben. Ionos folyadékokban ezzel szemben annyi reakcióelegyet kellett összeállítani, ahány
mintavétel történt, hiszen a GC-s elemzéshez az (R)- és (S)-2-klór-propionsav-butil-észtereket extrahálni kellett n-hexánnal az ionos folyadékból, majd ezt az extraktumot elemezni. Ez azt jelenti, hogy egyszerre 15 reakcióelegy került összeállításra, amelyekből a termékek extrakciója a mintavételi időpontoknak megfelelő időpontokban történt.
A reakciósebesség optimumgörbe szerint változott a víztartalom függvényében (3.7. ábra). A legnagyobb reakciósebességet 0.15 mol/dm3 vízkoncentráció mellett n-hexánban (8.9 x10-3 molh-1g-1) és 0.38 mol/dm3 vízkoncentrációnál [bmim]PF6 ionos folyadékban tapasztaltam. Toluolban és [onim]PF6 ionos folyadékban közel azonos volt az észterezési reakció sebessége (3.2x10-3 molh-1g-1 és 3.0x10-3 molh-1g-1), míg a polárosabb karakterű tetrahidrofuránban és [bmim]BF4-ben igen alacsony, 10-3 molh-1g1 sebességgel keletkeztek az észter termékek, és a reakció sebessége kis mértékű függést mutatott a vízkoncentrációtól.
A Candida rugosa lipáz enantioszelektivitása a vízkoncentráció függvényében szintén optimumgörbe szerint változott, értéke azonban kevésbé függött a vízkoncentrációtól, mint a reakciósebesség (3.8. ábra). Az enantioszelektivitás [onim]PF6 -ban és [bmim]PF6-ban moderált (25 és 19), míg a többi oldószerben inkább alacsonynak tekinthető. A klasszikus szerves oldószerek közül n-hexánban volt tapasztalható a legmagasabb enantioszelektivitás (E=10).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 0,2 0,4 0,6 0,8
cvíz (mol/dm3) Reakciósebesség x103 (mol/dm3 hg)
toluol n-hexán [bmim]PF6 [omim]PF6 [bmim]BF4 tetrahidrofurán
3.7. ábra: A reakciósebesség változása a kiindulási vízkoncentráció függvényében.
0
3.8. ábra. Az enantioszelektivitás (E) változása a kiindulási vízkoncentráció függvényében.
A 3.2. táblázatban összefoglaltam azokat a vízkoncentrációkat, amelyek mellett a maximális reakciósebesség (cvíz(konv)) illetve enantioszelektivitás (E) (cvíz(E)) elérhető.
Mivel a Candida rugosa lipáz enzim aktivitása és enantioszelektivitása optimumgörbe szerint változott a vízaktivitással, és oldószertől függetlenül azonos vízaktivitás mellett a legnagyobb a reakciósebesség illetve az enantioszelektivitás, valószínűsíthető, hogy minden oldószerben a megfelelő cvíz(konv) vízkoncentrációt beállítva a vízaktivitás azonos lesz a reakcióelegyekben. Ehhez hasonlóan minden oldószerben a megfelelő cvíz(E) vízkoncentráció beállításával a reakcióelegyek vízaktivitása jó közelítéssel azonos lesz. Közvetett módon tehát a reakcióelegyekben kvázi azonos vízaktivitást sikerült beállítani sópárok vagy telített sóoldatok használata nélkül is.
3.2. táblázat: Konverzió és enantioszelektivitás az (R,S)-2-klór-propionsav észterezésében cvíz(konv) és cvíz(E) vízkoncentrációk esetén.
(T=30 C, t=2 h)
Az 1.1. ábrán bemutattam a konverzió függését a Reichardt-féle polaritástól Pseudomonas capacia lipáz esetén. Hasonló megfigyelést tehetünk a log P érték függvényében végzett vizsgálatokkor is. A 3.9. ábrán a log P függvényében mutatom be a vizsgált reakció során a konverzió változását különböző oldószerekben. Látható, hogy a log P értékek csökkenésével az elért konverzió csökken, s akárcsak a Reichardt-féle polaritás függvényében végzett összehasonlításnál, az erősen negatív log P tartományba eső ionos folyadékok esetében a log P csökkenésével nő, vagyis mindkét fajta vizsgálatnál egy minimum görbe szerinti összefüggést fedezhetünk fel [62].
3.9. ábra: A testreakció konverziójának függése az oldószerek log P értékétől.
3.1.4. A Candida rugosa lipáz enzim szubsztrátspecifikussága 2-szubsztituált