Pufferválasztás bázikus csoportot tartalmazó vegyületek elválasztásához

In document Fekete Jenő, Kormány Róbert, Fekete Szabolcs A folyadékkromatográfi a fejlesztési irányai Gyors folyadékkromatográfi a (Pldal 116-119)

6. A pH mérés és hatása a folyadékkromatográfiás elválasztásra

6.6. Pufferválasztás bázikus csoportot tartalmazó vegyületek elválasztásához

A bázikus puffereknél láttuk, hogy a pKa érték a szerves oldószer tartalom növelésével általában a kisebb pH-k felé tolódik el. Az eltolódás iránya a bázikus csoportot tartalmazó vegyületekre is igaz. Amennyiben a szerves puffer és a bázikus csoportot tartalmazó vegyület pKa értéke közel esik, akkor az eltolódások között kisebb a különbség.

Ismételten hangsúlyozzuk, hogy folyadékkromatográfiában, amikor a pH beállítással változtatjuk a szelektivitást, a szabadsági fokunk az a pufferkapacitásból következĘen ±1 pH egység. Ehhez kell igazítanunk, hogy a bázikus csoportot tartalmazó vegyületnél az elválasztáshoz szükséges molekuláris forma meglegyen. Amennyiben a két feltételt össze tudjuk igazítani, akkor az, hogy milyen a pontos hidrogén-ion aktivitás az oldatban, nem elsĘdleges szempont. Fontosabb, ahogy ezt a puffer készítésnél leírtuk, hogy reprodukálhatóan elvégezhetĘ legyen.

Ha a bázikus csoportot tartalmazó vegyületek elválasztásakor bázikus puffert használunk, akkor az általános stratégiánk a mozgófázis pH-t tekintve a következĘk lehetnek. Ebben az esetben is az elsĘ kérdés, lehetséges-e ion visszaszorított formában az elválasztás. Itt jegyezzük meg, hogy az irodalom ezt a molekuláris formát a bázis semleges formájának nevezi, és ugyanezt alkalmazza a savakra is, ha ion visszaszorított formában van, ekkor ez a sav semleges formája.

Az ion visszaszorított formában történĘ elválasztás alapfeltétele, hogy a semleges formák között megfelelĘ LogP (apolaritás) különbség legyen. Ha ez megvan, akkor a pH-nak olyan értékĦnek kell lenni, hogy a semleges formák gyakorlatilag állandóak legyenek. Ezt pH oldaláról nézve úgy tudjuk megadni, hogy a közegben mért valódi pH érték legyen 2 egységgel nagyobb, mint a bázikus csoport adott közegben mért pKa értéke. Továbbá a puffer koncentrációjának minimumra csökkentése végett a pufferkapacitás legyen nagy (pKa

± 1). Természetesen az állófázis felsĘ pH határát az adott közegben nem haladhatjuk meg.

A hagyományos fordított fázisú tölteteknél 8 - 9-es érték, míg a pH-t jól tĦrĘ állófázisoknál 10 - 12.

Ez az érték egy bázisnál, amelynek a pKa értéke vízben 6, 8-as pH-t jelent. Ez igaz akkor, ha csak puffert használunk az elválasztásnál. A LogP • 1 értékĦ bázisoknál már több mint

10 % szerves oldószert kell alkalmaznunk. Ebben az esetben már mind a puffer, mind a bázikus csoportot tartalmazó vegyület pKa értéke csökkenni fog. Fontos, hogy a változás azonos irányú! A változás mértékében van ugyan különbség, de biztosan benne maradunk a

±1 pH egységben. Ez fontos, hogy a nagy pufferkapacitás megmaradjon.

A vizes oldatban mért pKa érték, amely alapján a puffer pH-t választottuk megfelelĘ támpont. Az elmozdulást bemutatjuk ábrán is (57. ábra).

57. ábra: A bázikus csoportot tartalmazó vegyületek és a puffer pKa értékének változása a szerves oldószer hozzáadására.

A bázikus csoportot tartalmazó vegyület pKa értékének savas irányban való eltolódása nem változtatja meg a molekuláris formát, ezzel a visszatartás is állandó lesz. A kompenzációs hatás miatt 50 tf.% víz-szerves oldószer tartalomig a vízben mért pKa értékek, mind bázikus csoportot tartalmazó vegyületekre, mind ennek alapján kiválasztásra kerülĘ puffereknél alkalmazhatók. 50 tf.% feletti szerves oldószer tartalomnál korrekciókat kell figyelembe venni. Általában ez a korrekció 90 tf.% szerves oldószerig nem haladja meg a 0,5 pH egységet. Ez annyit jelent, hogy maradva az elĘbbi példánál, a vízre mért pKa értéket 2,5 egységgel növeljük meg. Ez az érték már a gyártók által a fordított fázisú töltet felsĘ pH értéke fölött lehet, de ne feledjük, hogy a megadott érték vizes közegre vonatkozik. A szerves oldószer valódi pH értéke és az ezzel korrigált érték 1 - 2 pH egységgel is nagyobb lehet a specifikáltnál.

A fordított fázisú kromatográfia gyakorlatában a 70-80 tf.% feletti szerves oldószer tartalomnál szervetlen anyagokból összeállított tompító oldatokat nem használunk, mert oldhatóságuk nagymértékben csökken, amely só kiválást okoz. A kritikus szerves oldószer tartományban tehát szerves anyagokból összeállított puffert kell használnunk. Ekkor viszont

a pH beállítására. A gyakorlatban az ellenĘrzĘ mérésnél változtassuk meg a pH-t 0,5 egységgel, és ha a visszatartások változatlanok, akkor az ion visszaszorított elválasztást valósítottuk meg. Állófázis oldaláról nézve egy Silica B (nagy tisztaságú) és jól borított és utószilanizált töltetet kell alkalmazni. Az állófázis megkötése még kritikusabb, ha a bázikus csoport pK-ja körüli pH értéknél végezzük az elválasztást.

Ekkor a bázikus csoportok közel fele ionizált a másik fele ion visszaszorított formában van. Az elĘzĘekben csak a mozgófázis oldaláról tárgyaltuk a bázisos csoportokat tartalmazó vegyületek elválasztását. Ezt a hatást az állófázis minĘsége nagyban befolyásolhatja. Nincs tökéletesen borított fordított fázisú töltet, ezért a sztérikus okok miatt nem reagált, és a bázikus vegyület által hozzáférhetĘ szilanol csoportok egy része ionos formában van, a másik része ion visszaszorított, azaz savas formában. A vegyület bázikus csoportja és a savas szilanol csoport olyan erĘs sav-bázis kölcsönhatást alakíthat ki, amely csúcs aszimmetriához vezet. Ehhez járul az erĘs ionos (ioncserés) kölcsönhatás, amely a protonált bázikus csoport és az anionos formában lévĘ szilanol között fellép. Végkövetkeztetés, hogy bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél csak kis szilanol aktivitású (Silica B) és jól borított fordított fázisú tölteteket szabad alkalmaznunk. Ekkor az állófázis nem képes specifikus kölcsönhatásokat kialakítani a bázikus vegyületekkel, nem lesznek nagyon eltérĘ erĘsségĦ kölcsönhatások, így a szelektivitást elsĘdlegesen az állófázis szabja meg.

Ha szelektivitási okok miatt a bázikus csoportot tartalmazó vegyületek pKa értékei körül kell a pH-t beállítani, akkor vesszük a nagyobb pKa értékĦ bázist és ennek megfelelĘen állítjuk be a pH-t. Általában ehhez használhatjuk a vízben mért vagy az elĘrejelzett pKa értékeket. EllenĘrzésképpen a nagyobb pKa értékhez képest 0,5 egységgel csökkentsük a pKa értéket, és nézzük meg a szelektivitás változását. Azt fogadjuk el a további mérésekhez, amelyik esetben jobb az elválasztás. 50-80 tf.% között a nagyobbik pKa értékhez képest 0,5 pH egységgel csökkentsük a pH-t, majd 1 egységgel csökkentve ismét végezzük el a mérést.

Azt fogadjuk el a további mérésekhez, amelyik esetben jobb az elválasztás. Az egy egységgel történĘ pH csökkentés után is még megfelelĘ marad a pufferkapacitás. 80 tf.%

felett a csökkentést 1,5 pH egységgel kezdjük, majd az ellenĘrzést 2 pH egység csökkentésével végezzük el.

A bázisos csoportot tartalmazó szerves vegyületek elválasztásának harmadik lehetĘsége, ha protonált formában történik az elválasztás. Ennek nagy elĘnye, hogy ekkor a szilanol csoportok döntĘ többsége ion visszaszorított formában van, és csak gyenge kölcsönhatást tud kialakítani a protonált aminnal. Hátránya viszont a nagyságrendekkel csökkent visszatartás, amely ekkor az elválasztást is befolyásolja. Ekkor alapfeltétel, hogy a mozgófázisban mért pH érték a bázikus csoport pKa értékénél kettĘvel kisebb legyen.

Ismételten a mozgófázis szerves oldószer tartalmának hatását kell figyelembe venni a pKa értékre. 50 tf.%-ig ez a hatás a bázikus puffer és a bázikus csoportot tartalmazó szerves

vegyület pKa értékének azonos irányban történĘ változása miatt kismértékĦ. Ezért, ha elsĘnek a kisebb pKa értékĦ bázikus csoportot tartalmazó vegyület pKa értékéhez (pKa-2) állítsuk be a pH-t, az akkor jó indulási alap. EllenĘrzésképpen, a következĘ mérésnél ismét ehhez képest 0,5 egységgel csökkentsük a pH-t és a két mérést vessük össze majd a jobb elválasztást adó pH-án végezzük a további méréseket.

50-80 tf.% közötti szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál a kezdĘ pH érték a kisebbik pKa értékĦ bázikus csoportot kell figyelembe venni, és ehhez képest kell a pH értéket 0,5 egységgel csökkenteni, majd ellenĘrzésképpen újabb 0,5-es csökkentés következik. 80-100 tf.% közötti szerves oldószer tartalomnál a kisebbik pKa értékĦ bázikus csoporthoz képest állítsuk be a pH-t. A beállított pH legyen pKa-3 és az ellenĘrzést 0,5 pH egységnél nagyobb és kisebb értéknél is állítsuk be és végezzük el a mérést. A három mérés közül a legjobbat adót válasszuk a további mérésekhez.

Általános szabály, hogy a vízre kimért és/vagy elĘre jelzett pKa értékeket használhatjuk a bázikus csoportot tartalmazó vegyületek elválasztására, ha pH beállítására bázikus puffereket használunk.

6.7. Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek elválasztása savas pufferek

In document Fekete Jenő, Kormány Róbert, Fekete Szabolcs A folyadékkromatográfi a fejlesztési irányai Gyors folyadékkromatográfi a (Pldal 116-119)