Präsentation von Oberflächenmarkern auf humanen MSC

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 71-74)

4.1 HUMANE MSC DES KNOCHENMARKS

4.1.4 Präsentation von Oberflächenmarkern auf humanen MSC

Um Informationen darüber zu erhalten, ob die Kulturen humaner MSC homogen vorliegen und charakteristische Oberflächenantigene exprimieren, wurden diese durchflusszytome- trisch analysiert (Kapitel 3.2). Dabei wurden die MSC mit bekannten Markern hämatopoeti- scher und mesenchymaler Zellen in Einfachfärbungen und in Mehrfachfärbungen markiert und untersucht. Nach der Messung der Proben wurden diese mit PI versetzt, um nekrotische Zellen zu markieren und es erfolgte eine erneute Messung.

Die FACS Resultate werden in der Dot Plot Darstellung angegeben (Abbildung 4.4). Hier unterteilt ein Fadenkreuz den Dot Plot in vier Sektoren (I-IV): in zwei einfachpositive (I, IV), in einen doppeltpositiven (II) und in einen doppeltnegativen (III) Sektor. Auf den Dot Plot Achsen sind die jeweiligen Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Marker aufgetragen.

Es gilt festzuhalten, dass die untersuchten MSC Kulturen dreier Donoren in drei Passagen ein relativ einheitliches Bild in der Darstellung Vorwärtsstreulicht (FSC Height) gegen Seitwärtsstreulicht (SSC Height) zeigten (Abbildung 4.5). Hierbei war eine Hauptpopulation zu erkennen und von einer zweiten Population kleiner Zellen abzugrenzen. Innerhalb der Hauptpopulation war eine Subpopulation (hell) zu erkennen, die durch das Fenster R1 eingegrenzt wurde. Nur die Zellen, die innerhalb des Fensters R1 lagen, wurden in der Analyse berücksichtigt, da sie die große Mehrheit der Zellen präsentierten und darüber hinaus eine große Homogenität aufwiesen.

Abbildung 4.4: Exemplarische Dot Plot Dar- stellung der FACS Resultate für die Marker SH2 und SH3.

(I, IV) einfachpositiver, (II) doppeltpositiver (III) doppeltnegativer Sektor.

Abbildung 4.5: FACS Analyse von Primärkulturen dreier MSC Spender (P2).

Der Marker für Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) CD3 wurde als Isotypen- kontrolle (Negativmarker) genutzt. Dieser war in keiner der untersuchten Kulturen detek- tierbar (Abbildung 4.5), die somit frei von PBMC waren.

Die im Folgenden genannten Resultate der Präsentation von Oberflächenmarkern bezie- hen sich auf die Abbildung 4.5 und auf die Tabelle 4.1. Die Ergebnisse werden anhand der Antikörperpaare CD14/SH2, CD34/SH2, CD44/SH2, CD45/SH2 und ALCAM/SH2 diskutiert.

Humane mesenchymale Stammzellen sind in der Literatur als CD14-, CD34-, CD45-, ALCAM/CD166+, SH2/CD105+, SH3/CD73+, CD44+ und CD90+ beschrieben worden [Barry et al. 2004; Pittenger et al. 1999].

CD14 repräsentiert einen Marker für Monozyten. In keiner der Zellkulturen, unabhängig ob in der Passage zwei, drei oder vier, waren mehr als 0,5% der untersuchten Zellen positiv für diesen Marker. CD34, ein Marker für hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen und häufig zur Isolierung dieser mittels FACS Sortierung genutzt, war ähnlich wie CD14 über den gesamten Kulturverlauf kaum nachweisbar. Einfach CD45+ gefärbte Zellen waren in allen Kulturen kaum zu beobachten (Maximum 3%, im Sektor I). In manchen Ansätzen war aber eine CD45/SH2 Doppelfärbung zu erkennen (bis etwa 20% der Zellen, im Sektor II). Im Allgemeinem war dieser Leukozytenmarker über den Kulturverlauf (Passagen 2-4) in der Doppeltfärbung immer weniger nachweisbar, was darauf hinweist, dass die gewählten Kulturbedingungen die Anreicherung von CD45 positiven Zellen nicht unterstützen, bzw. deren Überleben nicht ermöglichen. Dagegen waren CD44, ein gegen den Hyaluronsäure- rezeptor gerichteter Antikörper, und ALCAM (CD166, SB10), in fast allen Kulturen doppeltpositiv mit SH2. Ausnahmen hiervon zeigten sich vor allem beim Donor zwei in der dritten Passage, wo sowohl CD44 als auch ALCAM nur einfach positiv waren (Tabelle 4.1). Wie zu erwarten, waren alle humanen MSC in jeder Passage überwiegend SH2- (einfach)positiv, bis auf MSC des Donors zwei, Passage drei, die negativ waren. Bei dem Antikörper SH2 (CD105), der an den TGFβ3 Rezeptor bindet, handelt es sich um den Zellmarker für mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark. Der Donor zwei war auch für die Präsentation anderer Marker sehr auffällig (Tabelle 4.1).

Tabelle 4.1: FACS Analyse von MSC Kulturen der Passagen 2, 3 und 4 (3 Spender). Es liegen z.B. in den in der Kombination CD14/SH2 gefärbten Proben (Passage P3, Donor 1) weniger als 0,5% der Zellen im Sektor I (einfachpositiv für CD14), weniger als 0,5% der MSC im Sektor II (doppeltpositiv für CD14/SH2), weniger als 0,5% der MSC im Sektor III (doppeltnegativ für CD14/SH2) und etwa 99% der Zellen im Sektor IV (einfachpositiv für SH2).

Sektor Passage 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 I P2 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 P3 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 77 0,5 < 0,5 3 < 0,5 < 0,5 96 < 0,5 P4 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 17 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 3 < 0,5 < 0,5 II P2 0,5 < 0,5 < 0,5 0,5 < 0,5 < 0,5 99 96 82 24 20 6 99 98 99 P3 < 0,5 < 0,5 0,5 1 1 3 98 2,5 66 23 < 0,5 3 98 < 0,5 97 P4 0,5 < 0,5 < 0,5 0,5 0,7 < 0,5 73 68 77 4 2 4 97 90 64 III P2 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 1 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 P3 < 0,5 94 < 0,5 < 0,5 43 2 1 20 0,5 < 0,5 97 1 < 0,5 4 < 0,5 P4 17 < 0,5 < 0,5 8 < 0,5 < 0,5 3 < 0,5 1 6 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 IV P2 99 99 99 99 99 99 0,6 3 18 76 80 94 < 0,5 2 < 0,5 P3 99 5 99 98 55 95 0,7 0,5 33 77 97 96 2 < 0,5 2 P4 82 99 99 91 99 99 7 31 22 90 98 96 < 0,5 9 36 CD14/SH2 CD34/SH2 CD44/SH2 CD45/SH2 ALCAM/SH2 Donor:

Es zeigt sich zusammengefasst, dass die gewählte Isolations- und Expandierungsmethode geeignet ist, multipotente mesenchymale Stammzellen hoher Quantität anzureichern und vital zu erhalten. Außerdem gewährleistet die FACS Analytik eine Beurteilung hinsichtlich der Homogenität und Qualität solcher Kulturen. Zellkulturen, wie z.B. die des Donors zwei in der dritten Passage, die eine abweichende Präsentation von Oberflächenmarkern aufwiesen, waren mittels dieser Technologie erkennbar und wurden für weitere Studien nicht verwendet.

Die bisher angeführten Marker wurden in dieser Arbeit regelmäßig zur Charakterisierung der mesenchymalen Stammzellkulturen herangezogen. Darüber hinaus sind weitere Ober- flächenmarker beschrieben worden. Zur Präsentation der MSC Marker SH3 (CD73) und CD90 wurden in dieser Arbeit keine systematischen Untersuchungen durchgeführt, dass Profil aller getesteten Kulturen entsprach aber qualitativ der Abbildung 4.6. Die Ecto-5’- Nucleotidase CD73 wurde schon vor längerer Zeit als einer der Marker für MSC beschrieben (Kapitel 1.2). CD90 (Thy1) ist ein stark glykolysiertes Zelloberflächenprotein, dessen Präsentation von Subpopulationen CD34+ hämatopoetischer Stammzellen seit langem be- kannt ist, aber auch von humanen MSC präsentiert wird [Lanza et al. 2001].

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 71-74)