5.3.1 Charakterisierung porciner MSC

Mit dem im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit optimierten Protokoll zur Isolierung und zur Kultur von porcinen mesenchymalen Stammzellen konnten erstmals multipotente porcine MSC isoliert werden [Ringe et al. 2002b]. Der Vorteil des Protokolls liegt dabei darin, dass die porcinen MSC aus gelatinösem Knochenmark von Knochen, die als Schlachtabfall anfallen, gewonnen werden. Die Vorgehensweise basiert auf einem von Haynesworth für die Gewinnung humaner MSC aus spongiösem Knochenmark entwickelten Protokoll [Haynes- worth et al. 1992b]. Dieses musste zur Isolierung porciner MSC modifiziert werden, während alle anderen Studien zur Expansion und zur multipotenten Differenzierung porciner MSC nach den auch für die humanen MSC verwendeten Protokollen durchgeführt wurden.

Wie den Ergebnissen zu entnehmen ist, war es mit dem Protokoll reproduzierbar möglich, aus etwa 4cm langen Knochenstücken Kulturen porciner MSC anzulegen. Die Wahl der Kulturbedingungen und Kulturmedien resultiere dabei in einer positiven Selektion von Zellen, deren morphologisches Erscheinungsbild, nämlich ein länglich fibroblastoides Aussehen, dem von MSC anderer Spezies entspricht [Worster et al. 2000; Johnstone et al. 1998; Wakitani et al. 1995; Caplan 1994]. Auch in den porcinen Kulturen traten zunächst individuell vorliegende Zellen auf, die potentiell den von Friedenstein beschriebenen CFUs entsprechen [Friedenstein et al. 1976]. Aus den Knochenstücken wurden etwa 10x107 mesenchymale und hämatopoetische Zellen gewonnen. Aus davon 3x105 pro cm2 ausgesäten Zellen, gingen am Ende der P0 etwa 2x104 Zellen pro cm2 hervor. Aus dem durchbluteten Knochenmark (rot) waren dabei deutlich mehr Zellen zu isolieren, als aus dem fettigen (weiß). Aktuell sind in der Literatur auch Protokolle beschrieben worden, nach denen porcine MSC ähnlich den humanen MSC aus Knochenmarkaspiraten gewonnen werden [Vacanti et al. 2005].

Ein Problem bei der Charakterisierung von MSC verschiedener Modellorganismen wie dem Schwein, dem Pferd und dem Kaninchen ist, dass oftmals die für humane MSC beschrie- benen Antikörper nicht verfügbar sind. Diese standen auch während der Durchführung der präsentierten Studie nicht zur Verfügung. Darum erfolgte hier mittels RT-PCR der Nachweis der Genexpression von SH2 und von ALCAM. Wie im Ergebnisteil bereits kurz diskutiert, waren die Transkripte von ALCAM und SH2 sowohl im porcinen Knochenmark als auch in den Isolaten direkt vor der ersten Aussaat nachweisbar. Darüber hinaus war über alle untersuchten Zellpassagen eine Expression beider Marker vorhanden. In jüngerer Zeit stehen immer mehr Antikörper für FACS Analysen zum Nachweis von porcinen MSC Oberflächenantigenen zur Verfügung. So wurde in der Literatur berichtet, dass porcine MSC HLA-I+, SH2+, CD29+, CD44+, CD90+ sowie HLA-II-, CD11B-, CD14-, CD34-, CD45- und CD133- sind [Mosocoso et al. 2005; Vacanti et al. 2005; Wang et al. 2006]. Dies entspricht

dem Profil humaner mesenchymaler Stammzellen [Otto & Rao 2004; Barry & Murphy 2004] und zeigt, dass auch porcine MSC kein spezifisches Antikörperprofil aufweisen, sondern auch Marker anderer Zelllinien (u.a. hämatopoetische wie CD90) präsentieren. Zukünftig könnte dieses bekannte Spektrum an präsentierten und nicht-präsentierten Antikörpern dafür genutzt werden, durch Zellsortierung homogenere Kulturen zu generieren.

Es gilt zu resümieren, dass das verwendete Zellkulturverfahren geeignet ist, um porcine MSC für die Differenzierungs Assays dieser Arbeit und für spätere in vitro und in vivo Studien, nicht nur im Rahmen des in situ Tissue Engineering, zur Verfügung zu stellen.

5.3.2 Multipotentes Differenzierungspotential

Der Nachweis des multipotenten Differenzierungspotentials erfolgte nach den Protokollen, die auch für die humanen MSC zur Anwendung kamen (Kapitel 3.3). Es ist bekannt, dass Glucocorticoide eine osteogene Entwicklung stimulieren. So werden durch das künstliche Glucocorticoid Dexamethason undifferenzierte Stammzellen in die osteogene Entwicklung gelenkt [Beresford et al. 1994; Bellows et al. 1990]. Das osteoinduktive Potential dieses Glucocorticoids spiegelt sich auch in einer von Dexamethason abhängigen Mineralisierung der Matrix humaner MSC wider [Haynesworth et al. 1992b]. Die mit Dexamethason osteogen induzierten Kulturen zeigten in dieser Arbeit nach etwa zwei Wochen eine Mineralisierung der Matrix (von Kossa Färbung), die über die Kulturdauer kontinuierlich zunahm. Die Kontrollkulturen waren auch am Tag 24 nicht von Kossa gefärbt. Diese Beobachtungen entsprechen den Literaturdaten, nach denen in osteogenen Kulturen humaner MSC etwa ab den Tagen 12-14 eine Mineralisierung nachweisbar ist [Jaiswal et al. 1997]. Wie auch bei der in vitro Differenzierung von Osteoblasten beobachtet wurde [Owen et al. 1990], zeigten die porcinen MSC bereits vor der Bildung mineralisierter Matrix einen Anstieg in der Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase. Die Aktivität der ALP war am Tag sechs ausgeprägter als in den Kontrollen am Tag 24. Die Stimulierung mit Dexamethason resultierte auch in einer Regulation der Markergene Kollagen Typ I, Osteocalcin, Osteopontin und Osteonectin. Deren Expression wurde im Ergebnisteil bereits im Kontext der von Owen berichteten Daten diskutiert. In letzter Zeit wurde ein osteogenes Potential aus Aspiraten isolierter porciner MSC in der Literatur bestätigt [Young et al. 2005; Vacanti et al. 2005; Riew et al. 2003].

Nach erfolgter Stimulierung war eine adipogene Entwicklung aufgrund der Bildung von Fetttröpfchen und der Expression der Markergene PPARγ und aP2 offensichtlich, und erfolg- te nur in den stimulierten Kulturen. Ein adipogenes Potential von porcinen MSC konnte vor kurzem in der Literatur bestätigt werden [Vacanti et al. 2005]. Die in der hier vorliegenden Arbeit durchgeführte Adipogenese porciner Zellen verlief sehr ähnlich wie die für humane Zellen beobachtete. Es waren in den porcinen Kulturen aber insgesamt weniger deutlich ausgeprägte Lipidansammlungen im Zytoplasma erkennbar. Letzteres kann mehrere Ursachen haben. So sind zum einen porcine Zellen im Vergleich zu humanen Zellen weniger insulinsensitiv [Ding et al. 1999]. Folglich könnte eine zu geringe Insulinkonzentration im Medium die weniger ausgeprägte Lipideinlagerung verursacht haben. Zum anderen könnte die Konzentration von IGF1 oder dessen Rezeptor limitierend gewesen sein. In porcinen Kulturen fördert Insulin vor allem die späten Ereignisse des Differenzierungsprogramms und erhöht die Fähigkeit der Zellen Lipide einzulagern [Boone et al. 1999]. Präadipozyten exprimieren nur wenige Insulinrezeptoren. Die Wirkung von Insulin wird hier durch eine

Kreuzreaktion mit dem IGF1 Rezeptor vermittelt [Rosen & Spiegelman 2000]. IGF1 ist ein Bestandteil des Serums im Medium und hier eine kritische Komponente [Smith et al. 1988]. Eine Supplementierung des Mediums mit IGF1 ermöglicht es, die adipogene Differenzierung in serumfreien Medium durchzuführen [Schmidt et al. 1990].

Die chondrogene Entwicklung von porcinen MSC wurde im hochdichten Kultursystem durchgeführt. Insgesamt verhielten sich die porcinen Kulturen wie die humanen. Die mit TGFβ3 und Dexamethason stimulierten Pellets zeigten eine kompakte knorpelige Struktur, während die nur mit Dexamethason behandelten Kulturen über den Kulturverlauf eine bindegewebsartige Struktur aufwiesen. Die Kontrollen sekretierten auch keine Proteoglycane und kein Kollagen Typ II. Offensichtlich war also TGFβ3 für die chondrogene Induktion verantwortlich. Auf dessen Rolle wurde in diesem Zusammenhang bereits mehrmals eingegangen. Im Gegensatz dazu wird die Wirkung von Dexamethason weniger verstanden. So ist in Gegenwart von Dexamethason eine chondrogene Entwicklung des Knorpels verschiedener skelettaler Elemente der Maus gestört [Silbermann et al. 1987], während die Chondrogenese in Organkulturen embryonaler Zellen der Maus in Gegenwart von Dexamethason stimuliert wird [Zimmermann & Cristea 1993]. Dexamethason löst in Kulturen von MSC des Kaninchens eine Chondrogenese auch in Abwesenheit von TGFβ1 aus [Johnstone et al. 1998], während es dies in humanen, porcinen und equinen Kulturen nicht kann. Dies steht im Einklang mit Studien, in denen die Wirkung von Gluco-Konjugaten auf die Differenzierung von porcinen Stromazellen (PBMSC) untersucht wurde [Noble et al. 1995]. Dextransulfat induzierte hier eine Kontraktion der Monolayerzellen zu zirkulären Zellaggregaten, die Kollagen Typ II positiv waren. Dexamethason löste hingegen keine Kontraktion aus und stimulierte die PBMSC nicht in die chondrogene Richtung.

In der Literatur wurde eine chondrogene Entwicklung bestätigt, diese erfolgte allerdings in Monolayerkulturen und wurde mit BMP7 transfizierten MSC durchgeführt [Vacanti et al. 2005|. Die zitierte Gruppe berichtet auch, dass porcine MSC währen der ex vivo Vermehrung ihr osteogenes und chondrogenes Potential verlieren, während das adipogene erhalten bleibt und in höheren Passagen sogar eine spontane Adipogenese beobachtet wird. In der vorliegenden Arbeit wurde in keiner porcinen MSC Kultur ein spontanes Auftreten der chondrogenen Entwicklungslinie beobachtet. Jedoch kam es wie bei den humanen MSC in seltenen Fällen zur spontan induzierten adipogenen und osteogenen Entwicklung. Dies ist erneut als Ausdruck des multipotenten Potentials und der Plastizität mesenchymaler Stammzellen zu deuten.

Es gilt festzuhalten, dass porcine MSC des Knochenmarks in dieser Arbeit routinemäßig isoliert werden konnten, deren Expressionsprofil an ausgewählten MSC-Markern während der Expansion stabil blieb und sich die Zellen in die osteo-, adipo- und chondrogene Richtung entwickelten. Aufgrund der gezeigten Ähnlichkeit zu den humanen MSC repräsen- tiert das Schwein ein viel versprechendes präklinisches Großtiermodell für die Stammzell- forschung und für das in situ Tissue Engineering. Hierauf wurde im Kapitel 4.8 bereits kurz eingegangen (Kapitel 4.8).

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 141-144)