6. A pH mérés és hatása a folyadékkromatográfiás elválasztásra
6.2. A pH mérés lehet Ę ségei és gyakorlata a folyadékkromatográfiában
A pufferek pH-ját viszonyítva az elsĘdleges és/vagy másodlagos pufferekhez, egyértelmĦen és reprodukálhatóan lehet mérni. Kérdéses viszont, hogy mit értünk a mozgófázis pH-ján és hogyan mérjük azt. Három lehetĘség kínálkozik a mozgófázis pH-jának beállítására:
Mérjük a puffer pH-t és ehhez adjuk a szerves oldószert.
Kalibráljuk az üvegelektródot az elsĘdleges és/vagy másodlagos pufferekre, és utána a kész mozgófázisban mérjük a pH-t.
A kalibrációnál az elsĘdleges és/vagy másodlagos puffereket a mozgófázisba mérjük be, és a mérést is a mozgófázisban végezzük el.
Az elsĘ esetben a pH alsó és felsĘ indexében is „w” kell, hogy szerepeljen, a második esetben, az alsó indexben „w”, a felsĘben „s”, a harmadik esetben mind az alsó, mind a felsĘ indexben „s”-nek kell szerepelni. A három mérési módszer három eltérĘ eredményt (számot) ad. Kérdés, hogy milyen szempontból lehet érdekes a „valódi” hidrogén-ion aktivitás. Az elsĘ lényeges kérdés, hogy a gyártó cégek által megadott pH tartomány a fordított fázisú töltetekre milyen módon mért értékre értendĘ. A másik lényeges kérdés kapcsolódik a proton funkciós vegyületek elválasztásához (a savas vagy bázikus csoportot tartalmazókra). Az ilyen típusú elválasztásoknál a pH alapvetĘ paraméter, mert a vegyületek pKa értékéhez képest kell beállítani.
Ahhoz, hogy a hidrogénion aktivitás hatását megértsük, vissza kell mennünk az ionaktivitás általános elméletéhez, nevezetesen a Debey-Hückel közelitéshez és a Bates-Guggenheim konvencióhoz. Az elĘbbi a termodinamikailag nem mérhetĘ egyedi hidrogén-ion aktivitás becslését teszi lehetĘvé, az utóbbi ezt kiterjeszti más oldószerekre is.
A Debey-Hückel összefüggés:
ahol ȖH az egyedi hidrogén-ion aktivitás, I az ionerĘsség, A és B konstansok, amelyek az oldószertĘl és a hĘmérséklettĘl függenek, és ao a szolvatált ionméret.
Az eredeti Bates-Guggenheim konvenció szerint az oldószer víz és a standard állapotot is erre vonatkoztatjuk, úgyhogy a hidrogén-ion koncentrációt végtelen kicsinek vesszük, akkor az ao*B értéke 1,5. Ha a fenti adatokat átvisszük más oldószerekre is, akkor az elĘbbi megközelítés szerint az alábbi összefüggést kapjuk:
> @
S W
H
SU
SH
WU
Sa B (50)
ahol a felsĘ index s az adott oldószert, míg w a vizet jelenti, İ az adott oldószer és víz permittivitását, ȡ pedig a sĦrĦséget.
Amennyiben a pH-t értelmezni akarjuk a fordított fázisú mozgófázisoknál, akkor a standard állapot nem lehet más, mint az adott oldószer, és ebben a hidrogén-ion koncentrációt végtelen kicsinek vesszük. Ez egy újabb hidrogén-ion skálát jelent. A vízre vonatkozó pH skálát szokás „abszolút” pH skálának nevezni.
A két pH skála megkülönböztetésére az IUPAC (Robinson és Stoke alapján) a következĘ megközelítést javasolja, amennyiben a pH-t az abszolút értékhez akarjuk hasonlítani, vagy kifejezni vele, akkor a pH alsó indexében „w” szerepel, és a felsĘ indexben „s”. Ha az adott közeg (oldószer) a viszonyítási alap, akkor az alsó és a felsĘ indexben is „s” szerepel:
amennyiben a vízre definiáljuk a standard állapotot, akkor a két skála megegyezik.
Ezeket a meggondolásokat kell alkalmaznunk az összes sav-bázis egyensúlyra is, ahol a pH-nak szerepe van. Ennek megfelelĘen a savi disszociációs állandó negatív logaritmusára is (pKa):
Ebben az összefüggésben a hidrogén-ion standard állapota, a víz és koncentrációja, illetve az aktivitási koefficiens értéke tart az egyhez, ha végtelen híg oldatban van, de az egyensúlyban résztvevĘ egyéb ionok vagy molekuláknál a viszonyítási alap az adott mozgófázis.
A XXII. – XXIV. Mellékletben, a folyadékkromatográfiában leggyakrabban alkalmazott oldószerekre adunk meg adatokat, amelyek segítségével a különbözĘ skálával definiált pH-k átszámolhatók. A táblázatban megadott pKap megegyezik az elĘbbi összefüggésben megadott, és az „abszolút” pH skálára visszavezetett értékkel. Itt jegyezzük meg, hogy pH*
vagy pKa* az adott mozgófázisra vonatkozó („s” alul és felül) jelölése volt régen.
Az elĘzĘkben látható, hogy a gyakorlatban miért lehet eltérĘen megadni és mérni a mozgófázis pH-ját, amely értékek a közegtĘl függĘen más és más hidrogén-ion aktivitást
jelentenek. Itt ismét vissza kell kanyarodnunk a pH munka-definíciójához, hogy egyértelmĦen értelmezni tudjuk a hidrogén-ion aktivitást a mozgófázisban. Továbbiakban kérdés, hogy a standard állapotot mire vonatkoztatjuk. Amennyiben indexek nélkül használjuk a kifejezést, akkor mindig a víz jelenti az oldószert. Folyadékkromatográfiás gyakorlatban, ahol az esetek döntĘ többségében vízzel elegyedĘ oldószereket használnunk, meg kall adnunk a vonatkoztatási (standard) állapotot. A mozgófázisra vonatkoztatva ez a következĘt jelenti:
E E gpH
pHX SS S S X S S
S
S (53)
ahol SSpHX jelenti a mozgófázisra vonatkoztatott pH értéket, SSpHS jelenti az ugyanolyan oldószerelegyben mért referencia pH értéket, mint a mozgófázis, SEX jelenti az ismeretlen oldatban mért elektromotoros erĘt, míg az SES jelenti a referencia oldatban mért elektromotoros erĘt, a g (ha mV-ban adjuk meg az elektromotoros erĘt), akkor 59 mV (Nersti viselkedés), másképpen a kalibrációs egyenes iránytangense. Ennél a kifejezésnél a határfelületen fellépĘ potenciáltól eltekintünk.
Ez egyben annyit is jelent, hogyha nem állnak rendelkezésünkre összefüggések a mozgófázis összetételének függvényében a pH változásról, akkor minden egyes összetételnél kalibrálnunk kell!
Néhány oldószerelegyre, bizonyos összetételig ezek az adatok rendelkezésre állnak. Így például víz-acetonitril elegyre 75 tf.%-ig és víz-tertrahidrofurán 72 tf.%-ig. A mérési adatokra görbéket illesztettek és ez alapján adták meg az adatokat (XXV. – XXVI. Melléklet). A táblázatokban mért adatokat késĘbb felhasználjuk a különbözĘ pH skálák összehasonlításánál.
A következĘ lehetĘség a pH mérésére a vizes közegben kalibráció és a mozgófázisban a mérés:
Ennél a módszernél csak a vizes puffer oldatra kell kalibrálni. Tehát az elĘzĘ módszerhez képest egyszerĦbb a kivitelezése.
A két eltérĘ módon mért pH érték egymásba átszámolható a következĘ összefüggések
ahol Ej a határfelületi potenciál, amely a referencia oldat és a mozgófázis között fellép.
Ennek értéke egy jól tervezett kombinált üvegelektródánál 0,01 pH nagyságrendbe esik. A gyakorlati számításoknál csak azzal a hatással kell számolnunk, amely akkor lép fel, ha a hidrogén-iont a vizes közegbĘl átvisszük a nem vizes közegbe.
ORJ WS
J
HG
(57)Ezeket az adatokat víz-metanol elegyre a teljes koncentráció tartományban ismerjük valamint részben a víz-acetonitril elegyre (lásd XXII. – XXIII. Mellékletben).
A két módon mért pH ugyanarra az oldószerre vonatkozik, csak a standard állapotban különböznek, amelyre az aktivitási koefficienst egységnyinek tekintjük. Metanolra vonatkozó adatokból látható, hogy jelentĘs eltérés csak a nagy szerves oldószer tartalomnál van.
Acetonitrilre az adatok csak 60%-ig vannak és itt az eltérés -0,44.
Folyadékkromatográfiás gyakorlatban elterjedt, hogy csak a puffer pH-ját mérjük. Ez gyakorlatilag a WWpH, ennek átszámolása az elĘzĘ két pH-ra nehézségekbe ütközik. Amíg a
WSpH és a SSpH értékek különbségét csak az oldószerek közötti önprotonálódási tényezĘkbeli különbség adja, addig csak a puffer pH-n alapuló mozgófázis megadásnál már a vizsgált vegyület is közbejátszik. Más oldalról nézve viszont a folyadékkromatográfiában arra kell választ adni, hogy a pKa ± 0,5 egységnél ne legyen nagyobb a különbség a mért és a valódi pH érték között. Ennek oka, hogy ebben a tartományban nagy a pH változás okozta szelektivitásváltozás, és a kromatográfiás gyakorlatban soha nem az abszolút értékek játsszák a fĘszerepet az elválasztásban, hanem a retenciók egymáshoz való viszonya.
Amennyiben a teljesen ionvisszaszorított vagy ionizált értéket akarjuk elérni, akkor is, ha vízben mért értékekhez képest a határt pKa ± 2-ben adjuk meg, akkor sem okoz 0,5 pKa egység elcsúszás az ionizáció mértékében nagymértékĦ változást. A XXII. – XXIV.
Mellékletben az SSpH-ra adtak meg empirikus összefüggést az acetonitril, metanol és tetrahidrofurán koncentrációjának függvényében. A kiindulási alap, a szervesoldószermentes puffer volt. Az adatok alapján megállapítható, hogyha ± 0,50 pH egység kritériumot alkalmazzuk, akkor a pufferre vonatkozó pH érték alkalmazható a mozgófázisra anélkül, hogy a szelektivitás (relatív retenció) jelentĘsen változna. Mivel a protolitikus folyamatokra a
vizes és nem vizes közegben ugyanazok az elméleti megfontolások igazak, mint amit bemutattunk a pH-ra, az elĘzĘekben elĘadottak érvényesek a pKa-ra is. A továbbiakban ezt nézzük át részletesebben. A 6. táblázatban néhány vegyület vizes közegben mért pKa
értékét mutatjuk meg.
6. táblázat: Nénány vegyület pKa értéke vizes környezetben.
Puffer pKa pH tartomány UV cut-off
6.3. A pKa értékek a mozgófázisban és alkalmazásuk a folyadékkromatográfiás