Multipotentes Differenzierungspotential von Periostzellen

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 136-138)

5.2 Humane Periostzellen des Mastoids

5.2.2 Multipotentes Differenzierungspotential von Periostzellen

Auf der Basis ihres osteo- und chondrogenen Potentials werden Periostzellen häufig als mesenchymale Stammzellen bezeichnet. Es ist aber bis heute nicht nachgewiesen worden, dass solche Stammzellen im Periost real existieren (Kapitel 1.3). So wurde vor dieser Arbeit noch nicht über eine adipogene Entwicklung berichtet. Um die Frage zu klären, ob Periost- zellen ähnlich den humanen MSC des Knochenmarks neben der osteochondrogenen, auch zur adipogenen Entwicklung befähigt sind, wurden diese unter Bedingungen kultiviert, die bei humanen MSC routinemäßig in einer Induktion der osteo-, chondro- oder adipogenen Ent- wicklung resultieren [Pittenger et al. 1999]. Die Ergebnisse der Differenzierungen sollen im Kontext der Differenzierung humaner MSC diskutiert werden.

Die in vitro mit Dexamethason, L-Ascorbinsäure-2-phosphat, β-Glycerophosphat und Kalziumchlorid osteogen stimulierten Periostzellen zeigten reproduzierbar bereits am Tag sechs, manchmal auch bereits am Tag drei, eine mineralisierte Matrix (von Kossa Färbung). Auch die ALP Aktivität war bereits am Tag drei höher als in den Kontrollen am Tag neun. Dieses ausgeprägte osteogene Potential steht im Einklang mit Literaturdaten [Redlich et al. 1999]. Im Vergleich mit eigenen Beobachtungen und auch mit der Literatur, war die Minerali- sierung früher als in den MSC Kulturen nachweisbar. So beobachtete Jaiswal eine Minerali- sierung etwa ab den Tagen 12-14 [Jaiswal et al. 1997]. In eigenen Studien erfolgte diese auch manchmal erst ab der dritten Woche.

Nach Stimulierung der in vitro Chondrogenese mit TGFβ3 zeigte sich, dass die Menge mittels immunhistochemischer Färbung nachgewiesenen Kollagen Typs II und mittels Alcianblau Färbung angefärbter saurer sulfatreicher Proteoglycane, über den Kulturverlauf zunahm. Im Vergleich dazu waren die nur mit Dexamethason behandelten Kontrollkulturen über den Kulturverlauf negativ für beide Färbungen. Der zeitliche Verlauf war nur zum Teil mit den in dieser Arbeit mit TGFβ3 chondrogen stimulierten humanen MSC vergleichbar. Die

humanen MSC zeigten bereits am Tag vier eine Alcianblau Färbung, präsentierten zu die- sem Zeitpunkt aber wie die Periostzellen noch kein Kollagen Typ II. Insgesamt war die Chondrogenese laut der Färbungen bei den MSC stärker ausgeprägt. Genauere verglei- chende Untersuchungen sind aus der Literatur nicht bekannt.

Über die Determinierung von mesenchymalen Stammzellen in die osteogene Linie und deren Entwicklung zu Knochen werden zunehmend mehr Details berichtet (Kapitel 1.4.3 und 1.4.4). Die Transkriptionsfaktoren CBFA1 und Osterix, die während der desmalen und der endochondralen Ossifikation für die Reifung von Osteoblasten mitverantwortlich sind, werden als Schlüsselfaktoren akzeptiert [Kobayashi & Kronenberg 2005]. Beide Arten der Knochen- bildung werden als unabhängige und nicht überlappende Prozesse angesehen. Dennoch wird im Rahmen der Frakturheilung der während der desmalen Ossifikation gebildeten Knochen eine Knorpelbildung beobachtet und Periostzellen, die aus solchen Knochen isoliert werden, besitzen ein chondrogenes Potential [Nah et al. 2000]. Wie bereits kurz diskutiert (Kapitel 1.3), sind dafür verschiedene Erklärungsansätze genannt worden: Die Chondrozyten könnten sich von MSC ableiten, von speziellen Chondroprogenitorzellen oder von osteogenen Zellen [Fang & Hall 1997]. Wie bei Fang & Hall zusammengefasst, gibt es für all diese Theorien experimentelle Hinweise, aber auch Daten die dem entgegensprechen. In einer neueren Studie wurde von Nah ein weiterer Erklärungsansatz genannt, nämlich dass im Rahmen der desmalen Ossifikation eine bisher nicht erkannte transiente chondrogene Phase durchlaufen wird, und das einzelne Zellen dieser Phase ihr chondrogenes Potential behalten sowie sich unter geeigneten Bedingungen in vitro und in vivo zu Knorpel entwickeln können [Nah et al. 2000]. Darüber hinaus ist basierend auf einem Rippenfrakturmodell berichtet worden, dass die Osteoblasten des Periost die Fähigkeit besitzen, sich sowohl in die osteogene als auch in die chondrogene Richtung zu entwickeln, und dass bei diesen Prozessen die Osteozyten eine zentrale Rolle einnehmen [Li et al. 2004].

Die adipogene Induktion mit Insulin, Dexamethason, 3-Isobutyl-1-methylxanthin sowie Indomethacin resultierte bei allen drei Donoren über den Kulturverlauf reproduzierbar in einer zunehmenden Formation lichtmikroskopisch bzw. mittels Oil Red O Färbung nachweisbarer Fetttröpfchen. Dies entspricht den für humane MSC des Knochenmarks publizierten Daten [Pittenger et al. 1999]. Ein Unterschied war, dass im Gegensatz zu den MSC Kulturen von Pittenger und auch zu den während dieser Arbeit durchgeführten Kulturen, generell auch die nur mit Insulin behandelten Kontrollen leicht positiv erschienen. Dies kann potentiell dahingehend interpretiert werden, dass Periostzellen sensitiver auf die Glucose oder auf das Insulin im Medium reagieren. Beide Medienbestandteile wirken sich positiv auf eine adipo- gene Entwicklung aus [Lehninger et al. 1994; Gimble et al. 1992]. Das adipogene Potential von Periostzellen wurde in einer aktuellen Studie bestätigt [Sakaguchi et al. 2005].

Die RT-PCR zeigte in allen stimulierten Kulturen eine Zunahme der Expression der Marker- gene aP2 und APM1 (Kapitel 1.4.2) am Tag 15 gegenüber dem Tag null. Dies traf für keine der Kontrollkulturen zu. Hier nahm die Expression ab oder blieb in etwa gleich. Eine adipo- gene Entwicklung ließ sich folglich auch auf der Genexpressionsebene nachweisen.

Adipozyten sind generell auf mesenchymale Stammzellen zurückzuführen und entstehen, vereinfacht ausgedrückt, in einem zweistufigen Prozess (Kapitel 1.4.2). Im ersten Schritt erfolgt die Festlegung der MSC auf die adipogene Linie und die Entwicklung zu Präadipo- zyten, im zweiten Schritt differenzieren diese zu reifen Adipozyten. Während zahlreiche

Schlüsselfaktoren der zweiten Phase, wie die Transkriptionsfaktoren PPARγ und C/EBPα, bekannt sind [Rosen 2005], ist dies für die erste Phase nicht der Fall. Hier spielen u.a. Zell- Zell und Zell-Matrix Interaktionen sowie Hormone eine potentielle Rolle [Rosen 2002]. Der transkriptionale Modulator TAZ co-aktiviert die CBFA1 abhängige Genexpression und suppremiert die PPARγ abhängige Genexpression (Kapitel 1.4.4) [Hong et al. 2005]. Durch Variation der Expression von TAZ kann in vitro und in vivo das Gleichgewicht zwischen Osteo- und Adipogenese verschoben werden. Dies deutet auf eine regulatorische Funktion von TAZ auf das Gleichgewicht zwischen beiden Entwicklungslinien hin. Darüber hinaus fördert eine PPARγ Insuffizienz die osteogene Entwicklung von mesenchymalen Stamm- zellen, während eine Überexpression von PPARγ in einer Inhibierung der CBFA1 Expression und somit der osteogenen Entwicklung resultiert [Lecka-Czernik 1999]. Auch C/EBPβ ist an der Regulation des Gleichgewichtes zwischen Osteo- und Adipogenese beteiligt, indem es in Kombination mit CBFA1 die Osteogenese unterstützt [Hata et al. 2005].

Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die Periostzellen des Mastoids eine multipotente Entwicklung zeigten. Neben den genannten Unterschieden im zeitlichen Verlauf und in der Ausprägung der einzelnen Entwicklungslinien war ein weiterer Unterschied zu den MSC, dass in keiner Periost Zellkultur eine spontan induzierte Adipogenese nachweisbar war. Zukünftig gilt es zu testen, ob sich das Potential dieser Zellen noch auf weitere Entwicklungs- linien erstreckt und sich somit weitere Tissue Engineering Anwendungen ergeben.

Obgleich in dieser Arbeit das multipotente Potential von Periostzellen gezeigt werden konnte, ist weiterhin unbewiesen, ob im Periost Stammzellen existieren. Diese Frage muss in weiterführenden Studien z.B. unter Verwendung klonaler Assays beantwortet werden. Diese sind für humane MSC des Knochenmarks durchgeführt worden (Kapitel 1.4.1), resultierten aber in widersprüchlichen Resultaten. Ein Modell der Stammzelldifferenzierung besagt, dass die Progenitorzellen der einzelnen Entwicklungslinien sich direkt von mesenchymalen Stammzellen herleiten [Caplan 1994]. Nach diesem Model ist zu erwarten, dass sich nach entsprechender Stimulierung, aus einem MSC Klon alle Phänotypen ableiten können. Muraglia beobachtete bei der Überprüfung dieses Modells, dass sich von 185 MSC Klonen, 184 in die osteogene Richtung entwickelten, etwa 80% ein osteochondrogenes Entwick- lungspotential zeigten und 30% sich in alle drei Richtungen (osteo-, adipo-, chondrogen) entwickelten [Muraglia et al. 2000]. Kein Klon entwickelte sich nur in die adipoosteogene, adipochondrogene oder nur in die adipogene oder chondrogene Richtung. Diese Daten legen eher das Vorhandensein einer Hierarchie der MSC Entwicklung nahe, in welcher die adipogene Richtung früher abweicht und unabhängig wird als die osteochondrogene Linie, die sich erst später aufteilt. Im Gegensatz dazu führten klonale Analysen immortalisierter MSC zu Klonen jeden Potentials mit Ausnahme des adipochondrogenen Phänotyps [Oka- moto et al. 2002]. Dies zeigt die Probleme und die Notwendigkeit solcher Analysen auf.

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