Jüngste Berichte über ihr Homing-, Migrations- und Engraftmentpotential erweitern das Anwendungsspektrum mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen deutlich. So konnte im nicht-humanen Primaten Modell (Pavian) gezeigt werden, dass GFP (Green Fluorescent Protein) oder ALP markierte MSC nach systemischer Infusion in das Knochenmark homen und dort nachweisbar sind [Devine et al. 2001]. In zwei von fünf Pavianen konnten die markierten Zellen noch nach einem Jahr nachgewiesen werden. In einer Folgestudie injizierten die gleichen Autoren drei Pavianen systemisch MSC, die ein retrovirales GFP Konstrukt enthielten [Devine et al. 2003]. Nach 9-21 Monaten war mittels real-time RT-PCR in gastrointestinalen Geweben, aber auch in der Niere, der Leber, der Lunge, dem Thymus und der Haut das GFP Transgen nachweisbar. MSC der Ratte, die nach einem Schlaganfall systemisch injiziert wurden, migrierten in das Nervengewebe und reduzierten dort funktionellen Defizite [Chen et al. 2001]. Wohl am meisten untersucht ist die Migration verschiedener Stammzellen zum Herzinfarktgewebe [Laflamme & Murry 2005]. So konnte nach systemischer Injektion von MSC der Ratte gezeigt werden, dass diese zum Infarktgewebe migrieren und dort verbleiben (engraften) [Barbash et al. 2003]. In einer weiteren Studie wurden MSC einer männlichen Ratte intravenös (1) drei Stunden nach erzeugtem Herzinfarkt, (2) drei Stunden nach vorgetäuschtem Herzinfarkt und (3) in gesunde weibliche Ratten injiziert [Jiang et al. 2005]. Nach einer bzw. acht Wochen wurde mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung die Expression des SRY (Sex Determing Region Y) Gens nachgewiesen. In den Gruppen eins und zwei waren SRY positive Zellen detektierbar, wobei die Zahl der in Gruppe eins gemessenen Zellen signifikant höher als die in der Gruppe zwei war. In der Kontrollgruppe drei waren keine Zellen messbar. Diese Resultate stehen im Einklang mit ähnlichen Berichten, in denen gezeigt wurde, das MSC nur nach erfolgtem Infarkt gerichtet dorthin migrieren. Auf eine Nutzung der Homing, Migrations und Engraftment Eigenschaften von MSC für das in situ Tissue Engineering wird noch eingegangen.

Über die den genannten MSC Eigenschaften zu Grunde liegenden Mechanismen ist wenig bekannt. Bisher sind einige Moleküle beschrieben worden, die in vitro eine migratorische Wirkung auf humane MSC aufweisen. Hierzu gehören Moleküle wie BMP2, BMP4, Isoformen von PDGF [Fiedler et al. 2002], VEGF-A [Fiedler et al. 2005] und Chemokine.

1.5.1 Chemokine und ihre Rezeptoren

Der Begriff Chemokin wurde vor etwa 15 Jahren geprägt, als sich immer mehr offenbarte, dass diese Klasse chemotaktischer Zytokine zwar Gemeinsamkeiten mit den Zytokinen hat, sich aber auch deutlich davon abgrenzt. Wie die Zytokine, sind die etwa 50 humanen Chemokine sekretorische, chemotaktisch wirkende Proteine, die entweder konstitutiv oder nach Induktion sezerniert werden und die ihre lokale Wirkung mittels parakriner und autokriner Effekte bewirken. Im Gegensatz zu den meisten Zytokinen sind Chemokine aber sehr viel kleinere Moleküle, deren Aktivität durch die Bindung an 18 G-Protein gekoppelte Rezeptoren initiiert wird. Insgesamt repräsentieren Chemokine eine Familie von Mediatoren von Entzündungsprozessen und des Immunsystems [Baggiolini 2001]. Sie wirken u.a als Chemoattraktanten auf Leukozyten und Blutstammzellen und modulieren die Angiogenese, die Wundheilung und die Tumorgenese.

Chemokine bestehen aus etwa 70-130 Aminosäuren, von denen die Position vierer Cysteine konserviert ist [Baggiolini 2001]. Die zwei Hauptfamilien, CC und CXC Chemokine, werden nach der Position der ersten beiden Cysteine (C) unterschieden. Diese sind bei CC Chemokinen benachbart und bei CXC Chemokinen durch eine Aminosäure getrennt. Die Cysteine formen zwei Disulfidbrücken (C1->C3 und C2->C4), die den Chemokinen ihre räumliche Struktur geben (Abbildung 1.10).

Es werden zwei N-terminale Regionen so in die Nähe gebracht, dass eine Erkennung des Chemokinrezeptors und eine biologische Aktivität gewährleistet sind. Es sind zwei Abweichungen von dieser Struktur bekannt. Das C Chemokin Lymphotactin weist nur zwei der sonst vier konservierten Cysteine und das CX3C Chemokin Fractalkin drei Aminosäuren zwischen den ersten beiden Cysteinen auf.

Um eine Systematik in die verwirrende Nomenklatur der Chemokine und ihrer Rezeptoren zu bringen, wurde vor einigen Jahren eine systematische Nomenklatur eingeführt [Zlotnik & Yoshie 2000; Murphy et al. 2000]. Die Rezeptoren werden danach als CC, CXC, XC und CX3C, gefolgt von einem R und einer Zahl bezeichnet. Chemokine werden ähnlich benannt, wobei das R durch ein L (Ligand) ersetzt wird (Tabelle 1.2; nächste Seite).

Verschiedene Studien zur Struktur und zur Aktivität von Chemokinen zeigten, dass CC und CXC Chemokine mindestens zwei wichtige Bereiche zur Wechselwirkung mit ihrem Rezeptor aufweisen. Einer dieser Bereiche befindet sich in der N-terminalen Domäne, während der andere Bereich sich im Schleifenbereich direkt hinter dem zweiten Cystein befindet [Crump et al. 1997]. Beide Bereiche werden durch Disulfidbrücken in räumliche Nähe gebracht. Der Rezeptor erkennt zunächst die Bindestelle in der Schleifenregion, die als Docking Domäne fungiert. Diese Bindung vermindert die Mobilität des Chemokins und fördert eine geeignete Orientierung der N-terminalen aktivierenden Domäne, die den Rezeptor aktiviert.

Abbildung 1.10: 3D-Struktur von CXCL12/SDF1α in Lösung, ermittelt mit NMR Spektroskopie. Alle Chemokine entsprechen etwa dieser Struktur.

(Links) Der Kern besteht aus antiparallelen β-Ketten, verbindenden Schleifen und wird durch Disulfidbrücken (gelb) zusammengehalten. Der N-Terminus (3-10 Amino- säuren) und eine C-terminale α-Helix (20-60 Aminosäuren) sind erkennbar. (Rechts) Projektion von 30 NMR Ansichten übereinander. Die Abbildung verdeutlicht einen relativ starren Kern und flexible C- bzw. N-terminale Enden.

(6Ckine: Chemokine With 6 Cysteines, BCA-1: B-Cell-Activating Chemokine-1, CTACK: Increased Serum Cutaneous T Cell-Attracting Chemokine, ENA-78: Epithelial Cell-Derived Neutrophil-Activating Factor, 78 Amino Acids, Eskine: Placenta and Skin-Associated CC Chemokine, GCP: Granulocyte Chemoattractant Protein, Gro: Growth-Related Oncogene, HCC: Hemofiltrate CC Chemokine, IP-10: Interferon-Inducible Protein-10, I-TAC: Interferon-Inducible T-cell α-Chemoattractant, MCP: Monocyte Chemoattractant Protein, MDC: Macrophage- Derived Chemokine, MEC: Mucosae-Associated Epithelial Chemokine, Mig: Monokine Induces by γ-Interferon, MIP: Macrophage Inflammatory Protein, MPIF: Myeloid Progenitor Inhibitory Factor, NAP-2: Neutrophil-Activating Protein-1, P B P : Platelet Basic Protein, RANTES: Regulated on Activation Normal T-Cell Expressed and Secreted, SCM-1: Single C Motif-1, SDF-1: Stromal Cell-Derived Factor-1, TCA: T-Cell Activation Protein, TARC: Thymus- and Activation-Related Chemokine, TECK: Thymus-Expressed Chemokine).

Verschiedene Chemokine wie CCL3, CCL4, CXCL4 und CXCL8 bilden Dimere oder Oligo- mere [Nesmelova et al. 2005; Clore & Gronenborn 1995], während andere, so CCL7, dies nicht tun [Kim et al. 1996]. Obwohl die 3D Struktur aller Monomere fast identisch ist, unter- scheiden sich die CC Dimere räumlich deutlich von den CXC Dimeren [Jin et al. 2005]. Bei den CC Dimeren liegt der N-Terminus, der wie erwähnt für die Aktivierung der Rezeptoren wichtig ist, maskiert im Molekülinneren vor, wohingegen dieser bei CXC Dimeren besser zugänglich ist. Neben Homodimeren sind auch Heterodimere wie CCL3/CCL4 und CXCL8/ CXCL4 beschrieben worden [Nesmelova et al. 2005; Guan et al. 2001]. Die Dissoziations- konstanten der einzelnen Chemokin Dimere liegen im mikromolaren Bereich, während für die biologische Aktivität von Chemokinen nur Konzentrationen im nanomolaren Bereich benötigt werden. Es ist aber bekannt, dass Chemokine über die basischen Aminosäuren ihrer C- terminalen α-Helix und ihres Kernmoleküls mit Glycosaminoglycanen interagieren, die auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Diese Wechselwirkung ist für eine Aggregation von Chemokinen und die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration auf der Zelloberfläche förderlich [Hoogewerf et al. 1997]. Dies deutet darauf hin, dass in vivo evt. eine Dimerisierung bzw. Oligomerisierung bevorzugt wird. Die Dimerisierung/Oligomerisierung scheint somit einen Prozess darzustellen, der je nach physiologischer Bedingung auftritt. Zahlreiche Studien zeigten, dass Mutanten, die keine Chemokin Dimere mehr bilden können, dennoch ihr

Tabelle 1.2: Chemokinrezeptoren und ihre humanen Liganden. Systematische und alte Bezeichnung. [nach Murphy et al. 2000]

Sub-Familie Humaner Chemokinligand Rezeptor

CC CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL7/MCP-3 CCR1 CCL8/MCP-2, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2 CCL16/HCC-4, CCL23/MPIF-1 CCL2/MCP-1, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL13/MCP-4 CCR2 CCL5/RANTES, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL11/Eotaxin CCR3 CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL24/Eotaxin-2 CCL26/Eotaxin-3

CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL17/TARC, CCL22/MDC CCR4 CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL8/MCP-2 CCR5

CCL11/Eotaxin, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1 CCL20/MIP-3α CCR6 CCL19/MIP-3β, CCL21/6Ckine CCR7 CCL1/I-309, CCL16/HCC-4 CCR8 CCL25/TECK CCR9 CCL27/CTACK, CCL28/MEC CCR10 CXC CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL8/IL-8 CXCR1 CXCL1/GRO-α, CXCL2/GRO-β, CXCL3/GRO-γ, CXCL5/ENA-78 CXCR2

CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8

CXCL9/Mig, CXCL10/IP-10, CXCL11/I-TAC CXCR3

CXCL12/SDF-1α CXCR4

CXCL13/BCA-1 CXCR5

CXCL16 CXCR6

XC XCL1/Lymphotactin, XCL2/SCM-1β CR

Potential sich an die jeweiligen Chemokinrezeptoren zu binden und diese zu aktivieren, konserviert haben. Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass die Monomere die aktiven Moleküle sind. So zeigte Fernando, dass eine Dissoziation von CXCL8 Dimeren essentiell für eine Bindung an den CXCR1 Rezeptor ist [Fernando et al. 2004]. Man geht heute davon aus, dass Chemokin Dimere keine Liganden für Chemokinrezeptoren darstellen. Es gibt auch keine Hinweise darauf, dass ein Zusammenhang zwischen der Dimerisierung von Chemokinen und der ihrer Chemokinrezeptoren besteht [Springael et al. 2005].

Bis heute sind zehn CC, sechs CXC, ein CX3C und ein XC Chemokinrezeptor identifiziert worden. Die sieben Transmembran Domänen dieser G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR, G-Protein Coupled Receptor) sind in die Lipiddoppelschicht der Zellmembran ein- gebettet [Gether 2000]. Die meisten Rezeptoren erkennen mehr als ein Chemokin und einige Chemokine binden an mehr als einen Rezeptor (Tabelle 1.2). Wie die meisten GPCR, wenn nicht alle, dimerisieren bzw. oligomerisieren auch die Chemokinrezeptoren. Homo- bzw. heterodimere Komplexe wurden bisher für CCR2, CCR5, CXCR2 und CXCR4 beschrieben. Hierüber berichtet Springael in einem aktuellen Übersichtsartikel [Springael et al. 2005].

Das klassische Modell zum Chemokin/Chemokinrezeptor Signalling umfasst eine Akti- vierung des G-Protein Signalweges [Baggiolino 2001]. Neuere Berichte über die CC und CXC Rezeptor gekoppelten Signalwege zeigen die hohe Komplexizität des Signallings auf [Honczarenko et al. 2005; New & Wong 2003].

1.5.2 Chemokine, Chemokinrezeptoren und MSC

Aktuelle Studien zur Expression von Chemokinrezeptoren und zur migratorischen Wirkung einzelner Chemokine resultierten in Teils widersprüchlichen Ergebnissen [Sordi et al. 2005; Luttichaux et al. 2005; Honczarenko et al. 2005]. Zusammengefasst präsentieren humane MSC die Rezeptoren CCR1, CCR4, CCR7, CCR9-CCR10, CXCR4-CXCR6 und CX3CR. Einen in vitro chemotaktischen Effekt haben die Chemokine CCL3, CCL5, CCL17, CCL19, CCL21, CCL25, CCL28, CXCL12, CXCL13, CXCL16 und CX3CL1 ausgelöst. Hierbei ist anzumerken, dass eine Präsentation des Chemokinrezeptors CXCR4 nur in zwei der drei Studien nachweisbar war und dessen Ligand CXCL12 (SDF1α; Stromal-Derived Factor 1α) auch nur in zwei Studien einen dosisabhängigen migratorischen Effekt auf MSC ausübte.

In einer Tierstudie wurde die Sekretion der Chemokine CXCL12 und CX3C von Ratten, denen (1) eine Verletzung des Nervus hypoglossus (Unterzungennerv) zugefügt wurde, (2) diese Verletzung nur vorgetäuscht wurde und (3) von normalen Ratten, untersucht [Ji et al. 2004]. Nach einer Woche zeigte sich in der ersten Gruppe gegenüber der zweiten Gruppe und der Kontrollgruppe eine signifikante Erhöhung der Sekretion beider Chemokine im Kern des Nervus hypoglossus. Eine geringe Sekretion von CXCL12 und CX3C war aber auch in den beiden letzteren Gruppen nachzuweisen. Nach zwei Wochen nahm die Sekretion signifikant ab. In einem weiteren Teil der Studie wurden CFDA-SE (Carboxyfluoreszein Diazetat Succinimidyl Ester) markierte MSC nach Verletzung des Nervus hypoglossus in die lateralen Ventrikeln des Hirns injiziert. Die Kontrollgruppen bestanden hier aus Ratten mit dem entsprechenden Defekt, (1) die nicht behandelt wurden, (2) die bis zum Setzen der Injektionsnadel behandelt wurden aber keine MSC erhielten und (3) Ratten, denen die Verletzung des Nervus hypoglossus nur vorgetäuscht wurde. Hier zeigte sich nach einer und zwei Wochen eine gegenüber allen Kontrollgruppen signifikant erhöhte Zahl an markierten

MSC, die zum Kern des Nervus hypoglossus migriert waren. Die Zahl nach zwei Wochen detektierbarer MSC war signifikant geringer als die nach einer Woche. Die Studie zeigt, dass Chemokine bzw. deren Rezeptoren aller Wahrscheinlichkeit nach entscheidend am Homing, der Migration und am Engraftment von MSC beteiligt sind. Darüber hinaus ist zu vermuten, dass eine therapeutische Zellinjektion zeitnah nach der Verletzung erfolgen muss, da die Sekretion der Chemokine rasch abnimmt. In einer ähnlichen Studie konnte gezeigt werden, dass nach einem Schlaganfall, in der Ratte CCL2 (MCP1; Monocyte Chemoattractant Mole- cule 1), dass normal kaum nachweisbar ist, stark exprimiert wird [Wang et al. 2002]. MCP1 wirkt auf die MSC der Ratte zumindest in vitro chemotaktisch.

Insgesamt gilt es festzuhalten, dass die Forschung von Chemokin/MSC Wechselwirkungen ganz am Anfang steht. Es sei noch darauf hingewiesen, dass die MSC nicht nur mit Chemo- kinen interagieren, sondern diese auch permanent oder nach Stimulation sezernieren [Honczarenko et al. 2005].

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 34-38)