Migratorischer Effekt der Chemokine CXCL8, CXCL12 und CCL2

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 88-92)

4.3 CHEMOKIN INDUZIERTE MIGRATION HUMANER MSC

4.3.2 Migratorischer Effekt der Chemokine CXCL8, CXCL12 und CCL2

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, einen gut handhabbaren Chemotaxis Assay für die Analyse der dosisabhängigen chemotaktischen Aktivität potentieller chemotaktischer Fak- toren wie Chemokine und Wachstums- und Differenzierungsfaktoren zu etablieren. Darüber hinaus sollte die chemotaktische Wirkung von potentiellen Kandidaten wie CXCL8 (IL8), von CXCL12 (SDF1α) und CCL2 (MCP1) bestimmt werden. Diese Faktoren wurden aus verschiedenen Gründen ausgewählt. Zum einen ist deren in vitro chemotaktischer Effekt auf Stromazellen des Knochenmarks beschrieben worden [Wang et al. 2002]. Zum anderen ist bekannt, dass sowohl die Sekretion von CXCL8 und CXCL12 als auch die von CCL2, während akuter Erkrankungen (wie Herzinfarkt, Schlaganfall) temporär zunimmt und dies potentiell wichtig für eine Rekrutierung von Stammzellen ist (Kapitel 1.5). Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit erstmals die Expression der Chemokinrezeptoren für CXCL8 (CXCR1/CXCR2) und für CCL2 (CCR2) durch humane MSC gezeigt werden.

4.3.2.1 Etablierung eines 96-Wellplatten Chemotaxis Assays

Basierend auf verschiedenen Veröffentlichungen zur Chemotaxis adhärent wachsender Zellen [Fiedler et al. 2002], und um einen hohen Testdurchsatz bei gleichzeitig geringem Verbrauch an Zellen und Reagenzien zu gewährleisten, wurde das 96-Well Chemotaxis- system ChemoTx der Firma Neuroprobe ausgewählt (Kapitel 3.5, Abbildung 3.1) und getestet. In diesem System migrieren die Zellen entlang eines Diffusionsgradienten von einem oberen Kompartiment der Multiwellplatte durch eine Polycarbonatmembran definierten Porendurchmessers in ein unteres Kompartiment und werden dort bzw. an der Filter- unterseite nachgewiesen. Wichtige Parameter, die ausgetestet werden mussten, waren die Aussaatdichte der humanen MSC (etwa 1x103 Zellen/mm2 Filteroberfläche), zeitliche Parameter (1-48h Assay Laufzeit), das Assay Medium (Serumkonzentration, serumfrei, Serumersatzreagenzien), der Porendurchmesser des Filters (6-12µm), eine Beschichtung der Platten bzw. des Filters (Kollagen, Fibronektin) und der Zellnachweis (auf der Membran mittels Hämatoxylin oder Hemacolor® Färbung, im unteren Kompartiment mittels MTS).

Das Ergebnis ist im Durchführungsprotokoll Kapitel 3.5 festgehalten. Hierbei hat sich eine Zellaussaat von 3x104 Zellen, eine Laufzeit von 20 Stunden, ein serumfreies Diätmedium, ein Porendurchmesser des Filters von 8µm, keine Beschichtung der Platten oder des Filters und der Zellnachweis mittels Hemacolor® Färbung und folgender mikroskopischer Auszählung als

am günstigsten erwiesen. Ferner hat sich herausgestellt, dass die humanen MSC zwar durch den Filter wandern, diesen aber nicht verlassen.

4.3.2.2 Chemotaktische Wirkung von CXCL8, CXCL12 und CCL2

Der etablierte Chemotaxis Assay konnte anschließend zur Untersuchung der dosis- abhängigen chemotaktischen Aktivität der Chemokine CXCL8, CXCL12 und CCL2 auf

humane MSC eingesetzt werden. Aus Untersuchungen zur Wirkung von Chemokinen auf Zellen ist bekannt, das die Dosis-Effekt-Kurve oft einen glockenförmigen Verlauf aufweist. Um einen solchen Verlauf nachweisen zu können, wurden die zu testenden Chemokine in einem Konzentrationsbereich von 1nM bis 1000nM eingesetzt. Zusätzlich ist jeweils eine Positivkontrolle (Assaymedium, ohne Chemokin, mit 10% FBS) und eine Negativkontrolle (Assaymedium ohne Chemokin, ohne FBS) parallel zum Assay mitgelaufen. Die Zahl an migrierten Zellen in der Positivkontrolle lag reproduzierbar zwischen 4-5x103. Die Zahl der in der jeweiligen Negativkontrolle migrierten Zellen wird in den folgenden Abbildungen (Abbildung 4.18-4.20) mit angegeben. Es wurden MSC von verschiedenen Donoren und in den Passagen zwei und drei getestet.

Multiwell Chemotaxis Assay mit CXCL8 als chemotaktischen Faktor

Der Abbildung 4.18 ist zu entnehmen, dass CXCL8, welches mit etwa gleich hoher Affinität an die Chemokinrezeptoren CXCR1 und CXCR2 bindet [Murphy et al. 2000], einen dosis- abhängigen chemotaktischen Effekt auf humane mesenchymale Stammzellen aufweist. Das Dosis-Effekt Maximum lag hierbei in zwei von drei Fällen bei einer Konzentration von 750nM (Abbildung 4.18 B, C). Ab einer CXCL8 Konzentration von etwa 100nM migrierten mehr

Abbildung 4.18: CXCL8/IL8 abhängige Migration humaner MSC. (A-C) Donor 1-3.

(OG) Mittelwert in der Negativkontrolle migrierter MSC + Standardabweichung. (UG) Mittelwert in der Negativ- kontrolle migrierter MSC - Standardabweichung.

Zellen als in der Negativkontrolle. Die Dosis-Effekt-Kurven wiesen keine echte Glockenform auf. Insgesamt war die Zahl gewanderter Zellen gering (<1%), was im ähnlichen in vitro System schon für die Wirkung von Chemokinen auf andere mesenchymale und nicht mesenchymale Zellen beschrieben worden ist [Wang et al. 2002].

Multiwell Chemotaxis Assay mit CXCL12 als chemotaktischen Faktor

Die drei Diagramme (Abbildung. 4.19 A-C) weisen darauf hin, dass etwa ab einer CXCL12 Konzentration von 250nM mehr Zellen als in den Negativkontrollen wanderten. Nur im oberen Diagramm (Abbildung 4.19 A) war ein Dosis-Effekt Maximum, nämlich bei 1000nM, zu erkennen. Die anderen beiden Abbildungen deuten darauf hin, dass das Maximum bei diesen beiden Donoren im Bereich zwischen 250nM und 1000nM lag. Eine genauere Aussage ist aufgrund der ausgeprägten Fehlerbalken nicht möglich (Abbildung 4.19 B, C). Die Zahl gewanderter Zellen war erneut gering und lag etwa im Bereich von mit CXCL8 stimulierten Zellen. Eine dosisabhängige Wirkung von CXCL12 wurde in letzter Zeit von anderen Arbeitsgruppen bestätigt [Honczarenko et al. 2005; Sordi et al. 2005].

Abbildung 4.19: CXCL12/SDF1α abhängige Migration humaner MSC. (A-C) Donor 1-3.

(OG) Mittelwert in der Negativkontrolle migrierter MSC + Standardabweichung. (UG) Mittelwert in der Negativ- kontrolle migrierter MSC - Standardabweichung.

Multiwell Chemotaxis Assay mit CCL2 als chemotaktischen Faktor

Im Gegensatz zu den bisher getesteten Chemokinen, konnte CCL2 in keiner Konzentration und in keinem Assay eine eindeutige Wanderung von mehr MSC als in den Negativ- kontrollen stimulieren (Abbildung 4.20 A, B, C).

Es bleibt festzuhalten, dass im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit erstmals das komplette Chemokinrezeptor Expressionsprofil humaner mesenchymaler Stammzellen vorgestellt werden konnte [Ringe et al. 2003], ein Migrationsassay etabliert werden konnte und erstmals der Nachweis erfolgte, dass IL8, aber nicht MCP1 eine dosisabhängige Migration auslösen. Somit konnte hier der Proof of Principle für die Eignung von Chemokinen als Rekrutierungs- faktoren im Rahmen des in situ Tissue Engineering gezeigt werden und erste potentiell in präklinischen Tierstudien zu testende Faktoren bestimmt werden.

Abbildung 4.20: CCL2/MCP1 abhängige Migration huma- ner MSC. (A-C) Donor 1-3.

(OG) Mittelwert in der Negativkontrolle migrierter MSC + Standardabweichung. (UG) Mittelwert in der Negativ- kontrolle migrierter MSC - Standardabweichung.

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 88-92)