Ein Homing, Migrations und Engraftment Potential von Periostzellen ist bisher nicht gezeigt worden. Periostzellen sind aber an der Homöostase und an der Regeneration von Knochen beteiligt, so dass die Arbeitshypothese dieses Teils der Arbeit lautete, dass es im Rahmen dieser Prozesse zur gerichteten Migration von Periostzellen kommt. Erste Hinweise auf eine Migration dieser Zellen während der Knochenheilung lieferten vor einigen Jahren bereits die Gruppen von Caplan und Reddi. Ersterer berichtete, dass nach erfolgter Transplantation von Biomaterialien in Knochendefekte neben den MSC des Knochenmarks auch Periostzellen zum Material migrieren, dort adhärieren und zu Knochen differenzieren [Ohgushi & Caplan 1999]. Reddi hat vorgeschlagen, dass Faktoren der Knochenmatrix, wie BMPs, solche Prozesse initiieren und steuern [Reddi 1998].

Hier sollten einleitende Untersuchungen zum Chemokinrezeptor Expressionsprofil von humanen Periostzellen und zum dosisabhängigen migratorischen Effekt von CXCL12/SDF1α auf diese Zellen durchgeführt werden, und die Ergebnisse mit humanen MSC verglichen werden.

1,00E-03 1,00E-02 1,00E-01 1,00E+00 CXCR1 CXCR2 CXCR3 CXCR4 CXCR5 CXCR6 PC_1 PC_2 PC_3 1,00E-03 1,00E-02 1,00E-01 1,00E+00 CCR7 CCR8 CCR9 CCR10 CX3CR XCR PC_1 PC_2 PC_3 1,00E-04 1,00E-03 1,00E-02 1,00E-01 1,00E+00 CCR1 CCR2 CCR3 CCR4 CCR5 CCR6 PC_1 PC_2 PC_3 Rezeptoren Rezeptoren Rezeptoren Expression in % GAPDH Expression in % GAPDH Expression in % GAPDH

A

B

C

4.7.1 Chemokinrezeptor Expressionsprofil humaner Periostzellen

4.7.1.1 Expression auf mRNA Ebene

Der Nachweis der Chemokinrezeptor Expression mittels real-time RT-PCR erfolgte anhand der mRNA dreier Periost Donoren (Passage zwei). Es wurden die auch für MSC verwen- deten Oligonukleotide benutzt, deren Spezifität für die 18 Chemokinrezeptoren dort mittels Sequenzanalyse nachgewiesen worden war.Der Abbildung 4.33 ist zu entnehmen, dass neben den humanen MSC (Abbildung 4.16), auch die humanen Periostzellen ein breites Spektrum von Rezeptoren für Chemokine aller vier Subfamilien CC, CXC, CX3C und XC exprimierten. Auch hier war die Expression aller Chemokinrezeptoren, berechnet in % der Expression des Haushaltsgens GAPDH, gering und bewegte sich im Bereich von 10-4% bis circa 10-1%. Die Rezeptoren CCR2, CCR8, CCR10, CXCR4, CXCR5, CXCR6 und XCR wurden am stärksten exprimiert. Dieses Spektrum an Rezeptoren wurde mit Ausnahmen auch von den humanen MSC am stärksten exprimiert. Bei den MSC gehörte CCR7 zu den am höchsten nachgewiesen Rezeptoren. CCR2 und vor allem CXCR4, der CXCL12/SDF1α Rezeptor, gehörte bei den MSC nicht zur Gruppe der am höchsten exprimierten Rezeptoren.

Abbildung 4.33: Semiquantitative Bestimmung des Chemo- kinrezeptor Expressionsprofils, (real-time RT-PCR, n=3, P2). (A) CCR1-CCR6, (B) CCR7-CCR10, CX3CR, XCR, (C) CXCR1-

4.7.1.2 Präsentation auf Proteinebene

Wie bei den MSC erfolgte der Nachweis des Chemokinrezeptor Expressionsprofils auf der Proteinebene mittels mono- bzw. polyklonaler Antikörper. Die Ergebnisse werden tabel- larisch aufgeführt (Tabelle 4.5).

Auch die humanen Periostzellen präsentierten auf der Protein Ebene ein breites Spektrum an Chemokinrezeptoren. Hierbei gilt es festzuhalten, dass die Expression im Vergleich zu humanen MSC (Tabelle 4.2) uneinheitlicher war. So exprimierten nicht alle drei Periost Donoren alle sechs CXC Rezeptoren. Insgesamt vielen mehr Antikörperfärbungen negativ aus als bei den humanen MSC. So waren die Rezeptoren CCR3, CCR4 und CCR7 nicht nachweisbar. Darüber hinaus waren CCR5, CCR6, CCR8, CCR10 und CX3CR nur bei jeweils einem von drei Donoren nachweisbar. CCR8 und CCR10 gehörten auf mRNA Ebene zu den am stärksten exprimierten Rezeptoren. Der auf mRNA Ebene ebenfalls relativ stark exprimierte Rezeptor CXCR4 war auf Proteinebene bei zwei von drei Donoren nachweisbar. Dessen Ligand CXCL12 wurde im weiteren Verlauf der Arbeit hinsichtlich seiner dosisabhängigen migratorischen Aktivität auf Periostzellen getestet. Zum Nachweis des Rezeptors für XC Chemokine war auch hier kein Antikörper verfügbar.

4.7.2 CXCL12 induzierte Migration humaner Periostzellen

Der im Verlauf der Arbeit etablierte Chemotaxis Assay wurde dafür genutzt, erstmals die migratorische Wirkung eines Chemokins (CXCL12/SDF1α) auf humane Periostzellen zu beschreiben. Dabei wurde nach dem gleichen Protokoll wie für humane MSC vorgegangen (Kapitel 3.5, 4.3.2).

Sub-Familie Chemokin Rezeptor Donor 1 Donor 2 Donor 3

CC CCR1 + - + CCR2 + - + CCR3 - - - CCR4 - - - CCR5 + - - CCR6 + - - CCR7 - - - CCR8 + - - CCR9 + + + CCR10 + - - CXC CXCR1 + + - CXCR2 + + + CXCR3 - + - CXCR4 + + - CXCR5 - + - CXCR6 + + - CX3C CX3CR - + - C CR kA kA kA

Tabelle 4.5: Immunhistochemischer Nachweis der Chemokinrezeptor Präsentation auf Protein Ebene (n=3, Passage 3).

Die Diagramme A und B der Abbildung 4.36 zeigen, dass die Zugabe von CXCL12 über einen weiten Konzentrationsbereich einen migratorischen Effekt auslöste. Wegen der teils ausgeprägten Fehlerbalken ist nicht eindeutig festzulegen, welches die optimale Dosis-Effekt Konzentration war. Eine Dosis im Bereich von 500nM-750nM schien aber bei zwei von drei Donoren (Abbildung 4.34 A, B) in der größten Zahl migrierter Zellen zu resultieren (etwa 3% der eingesetzten Periostzellen). Die Zellen des Donors drei wanderten, vor allem in den Bereichen höherer CXCL12 Konzentrationen, im Vergleich zu den Donoren eins und zwei schlechter. Beim Donor eins war die Zahl migrierter Zellen ab einer Konzentration von 10nM höher als in der Negativkontrolle, beim Donor zwei bereits ab 1nM.

Es gilt festzuhalten, dass im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, dass Periost- zellen ein MSC-ähnliches Potential aufweisen und darüber hinaus der Proof of Principle erbracht wurde, dass diese Zellen potentiell für in situ Tissue Engineering Ansätze von Interesse sind. Letzteres ergibt sich aus der erstmaligen Präsentation des Chemokinrezeptor Expressionsprofils und den Nachweis, dass CXCL12 eine dosisabhängige Migration auslöst

Abbildung 4.34: CXCL12/SDF1α abhängige Migration humaner Periostzellen. (A-C) Donor 1-3.

(OG) Mittelwert in der Negativkontrolle migrierter Zellen + Standardabweichung. (UG) Mittelwert in der Negativ- kontrolle migrierter Zellen - Standardabweichung.

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 106-110)