1.4 DIFFERENZIERUNG VON FETT, KNORPEL UND KNOCHEN

1.4.4 Knochen und die osteogene Entwicklung

Das Knochengewebe ist das Stützgewebe des Körpers. Sein formgebendes Prinzip basiert auf nicht-zellulären Strukturen, nämlich einer organischen Grundsubstanz mit eingelagerten Kalksalzen. Die organische Grundsubstanz aus Proteoglycanen und Glycoproteinen besitzt zahlreiche eingelagerte Kollagenfasern die zu Fibrillen aggregieren und ist biegungselas- tisch. Die anorganische Hartsubstanz des Knochens besteht zu etwa 85% aus Kalzium- phosphat, zu 10% aus Kalziumcarbonat und zu 5% aus Alkali- und Magnesiumsalzen. Wichtige Knochencharakteristika, wie die physikalische Härte und die biologische Plastizität, beruhen auf der Integration von organischer und anorganischer Substanz. Das Skelett und somit auch die meisten Knochen werden letztlich von drei Zelltypen generiert. Chondrozyten (Kapitel 1.4.3) und Osteoblasten sind mesenchymalen Ursprungs, während die Osteoklasten dem hämatopoetischen System zugeordnet werden. Dabei wird während der Knochen- entwicklung aber auch der Knochenhomöostase die Aktivität der den Knochen aufbauenden Osteoblasten und der den Knochen resorbierenden Osteoklasten genau reguliert.

Die Knochenentwicklung erfolgt entlang zweier unterschiedlicher Entwicklungswege, näm- lich der desmalen- und der endochondralen Ossifikation. Durch die desmale Ossifikation werden die Schädelknochen und Teile der Gesichtsknochen angelegt. Während dieser bil- den sich Kondensationen mesenchymaler Stammzellen, die dann direkt in die Knochen- matrix produzierende Osteoblasten differenzieren. Bei der endochondralen Ossifikation, durch die die Knochen des axialen und des appendikulären Systems sowie die meisten Gesichtsknochen gebildet werden, erfolgt zunächst die im Kapitel 1.4.3 zusammengefasste Bildung eines knorpeligen Primordialskeletts, welches im Rahmen der Osteogenese durch Osteoklasten resorbiert und letztlich durch von Osteoblasten sezernierte Knochenmatrix ersetzt wird. Das Längenwachstum und die Heilung erfolgt hier wie bei der endochondralen Ossifikation. Das Längenwachstum erfolgt bidirektional, wobei kontinuierlich knorpelige Strukturen aufgebaut, resorbiert und durch Matrix ersetzt werden. Von der Peripherie zum Zentrum des Knochens wird in der Wachstumszone ein Gradient sich differenzierender Chondrozyten ausgebildet (Abbildung 1.8).

Abbildung 1.8: Differenzierungsstadien in der Knochenwachstumszone während des Längenwachstums. [Stevens et al. 1999; Molecular and Cellular Endocrinology]

Histologisch wird zwischen einer Reservezone, einer proliferativen, einer prähypertrophen und einer hypertrophen Zone unterschieden. Die ruhenden Zellen der Reservezone haben eine sehr geringe Teilungsaktivität, während die proliferative Zone durch Zellvermehrung und Bildung chondrogener Matrix gekennzeichnet ist. In der prähypertrophen Zone sind die Zellen voll von Knorpelmatrix umgeben. Eine beginnende Kalzifizierung der Matrix ist nach der Differenzierung zu hypertrophen Chondrozyten zu beobachten [Erlebacher et al. 1995]. Auf diesen Entwicklungsprozess, der mit der Apoptose der meisten Chondrozyten endet, folgt eine Differenzierung dem Knorpel benachbarter mesenchymaler Zellen zu Osteo- blasten, eine Invasion von Blutgefäßen und von Osteoklasten und der Ersatz der Knorpel- matrix durch trabekulären Knochen. Hypertrophe Chondrozyten spielen eine Schlüsselrolle in der Koordination von Chondrogenese und Osteogenese, da sie die Matrix für die Bildung des trabekulären Knochens präsentieren und die Bildung der Knochenstrukturen modulieren, aus denen der kortikale Knochen hervorgeht.

Nach Aubin und Caplan leiten sich die Osteoprogenitorzellen von mesenchymalen Stamm- zellen ab, die der Ursprung zur Differenzierung einer Reihe von festgelegten und definierten Entwicklungslinien sind [Aubin et al. 2001; 1995; Caplan 1991] (Abbildung 1.9).

Abbildung 1.9: Schematische Darstellung von Zellstadien und der Marker- präsentation während der Osteogenese. Die Angaben basierend auf in vitro und in vivo Studien. Es gilt anzumerken, dass die Angaben in der Literatur nicht völlig einheitlich sind und das bekannt ist, dass es z.B. Subpopulationen von Osteo- blasten gibt, die alle ALP positiv sind und das Gen für den PTH/PTHrP Rezeptor exprimieren, deren Expression besonders der nicht-kollaginösen Matrixproteine aber stark variiert.

(+) nachweisbar, (-) nicht nachweisbar, (?) fraglich. [nach Aubin 2001; Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders]

Osteozytischer Osteoblast

MSC progenitorOsteo- osteoblastPrä- Osteoblast Osteozyt

Lining Cell Apoptose Adipozyt Chondrozyt OBERFLÄCHENMARKER SH2 + - - - - ALCAM + + - - - TRANSKRIPTIONSFAKTOREN CBFA1 + ? ? + ? ENZYME ALP ? + + + - MATRIXPROTEINE Koll. Typ 1 + + + + - Osteocalcin - - - + - BSP - -(+) + + + Osteopontin - -/+ + + + FAKTOREN/REZEPTOREN PTHRP ? -/+ + + + PTH/PTHRP-R ? + + + - ADHÄSIONSMOLEKÜLE CD44 + + + + +

Es ist noch nicht völlig geklärt, welche regulatorischen Moleküle die Differenzierung der multipotenten MSC induzieren und kontrollieren. Da das aktuell verfügbare Spektrum an Markern für frühe Differenzierungsstadien begrenzt ist, ist es vor allem schwierig, Aussagen über Präosteoblasten oder noch frühere Entwicklungsstadien zu machen. Vereinfacht lässt sich die osteogene Entwicklung von der Stammzelle bis zum Osteozyten in die Zellstadien mesenchymale Stammzelle, Osteoprogenitorzelle, Präosteoblast, Osteoblast, osteozytischer Osteoblast und Osteozyt unterteilen. MSC sind CBFA1 positiv und in vitro positiv für die Marker SH2 und ALCAM (Abbildung 1.9), während Osteoprogenitorzellen nur ALCAM positiv sind [Bruder et al. 1997a]. Beide Zelltypen zeichnen sich durch eine hohe Zell- teilungsaktivität aus. Der Nachweis von alkalischer Phosphatase (ALP) und von Kollagen Typ I in diesen Zellstadien wird in der Literatur unterschiedlich angegeben. Auch die

Präosteoblasten können sich weiterhin teilen, sind ALP positiv und synthetisieren Bone

Sialoprotein (BSP) sowie Kollagen Typ I. Osteoblasten teilen sich nicht mehr und produ- zieren alle für die Knochenbildung notwendigen Matrixkomponenten, wie Osteocalcin und BSP. Es sei darauf hingewiesen, dass Subpopulationen von Osteoblasten nachgewiesen worden sind. ALP und der PTH/PTHrP Rezeptor scheinen ubiquitäre in vivo Marker dieser Osteoblasten zu sein, während alle anderen Marker sowohl auf mRNA- als auch auf Protein- ebene ein Expressionsmuster abhängig von der Subpopulation aufweisen [Aubin 2001]. Dies ist auch deshalb von Interesse, weil die einzelnen Matrixmoleküle eine regulatorische Wir- kung auf die Osteogenese haben. Etwa 10-20% der Osteoblasten werden in Osteozyten umgewandelt, außerdem entwickeln sich so genannte Lining Zellen. Die meisten Osteo- blasten (65%) unterliegen nach der Erfüllung ihrer Aufgabe der Apoptose [Manolagas 2000].

In Primärkulturen von Osteoblasten, die aus Kalvarien oder trabekulärem Knochen isoliert wurden, exprimieren die Zellen im Verlauf der Osteogenese ALP, Kollagen Typ I und alle nicht-kollagenösen Proteine der Knochenmatrix. Darüber hinaus bilden die Zellen unter osteogenen Kulturbedingungen (Kapitel 3.3.3) knochenähnliche Knötchen (Nodules) aus. Diese weisen histologisch, ultrastrukturell und immunhistochemisch nachweisbare Merkmale von geflochtenem bzw. embryonalem Knochen auf. Owen hat die Bildung der Nodules untersucht und es zeigte sich, dass diese sich aus den drei sequentiell ablaufenden Phasen Proliferation, Bildung und Reifung der Matrix sowie Mineralisierung zusammensetzt [Owen et al. 1990]. Diese drei Phasen unterscheiden sich u.a. in der Expression von den mit der Proliferation und der Osteogenese assoziierten Genen [Aubin et al. 1995].

Die Transkriptionsfaktoren CBFA1 und Osterix gelten als wichtige Schlüsselfaktoren der Osteogenese im Rahmen der desmalen- und der endochondralen Ossifikation. CBFA1 wird in Progenitorzellen, Chondrozyten und Osteoblasten exprimiert (Kapitel 1.4.3). CBFA1-/- Knock-out Mäuse zeigen keine Knochenentwicklung [Otto et al. 1997; Komori et al. 1997]. Der Abbruch der Osteogenese erfolgt bereits während der frühen Knochenentwicklung, weil mesenchymale Zellen aus dem Periost bzw. dem Perichondrium nicht in die mineralisierte Knorpelmatrix einwandern können und auch keine Degradation der Matrix durch Osteo- klasten erfolgt [Komori et al. 1997]. Auch eine Überexpression von CBFA1 in Osteoblasten resultiert in einer mangelhaften Knochenbildung [Liu et al. 2001]. Insgesamt weisen diese Daten darauf hin, dass CBFA1 verschiedene Prozesse der Osteogenese reguliert [Ducy et al. 1999]. CBFA1 wird zum einen durch Phosphorylierung reguliert, interagiert aber mit einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren wie Smad1, -3, -5, Menin, STAT1 (Signal Transducer

and Activator of Transcription 1) und Twists [Kobayashi & Kronenberg 2005]. Zahlreiche Gene die von reifen Osteoblasten exprimiert werden, wie Osteocalcin, BSP, Osteopontin und Kollagen Typ I, sind Zielgene von CBFA1 [Ducy 2001]. CBFA1 spielt auch während der Invasion von Blutgefässen eine kritische Rolle. In Mäusen, die keine CBFA1 Expression zeigen, ist auch keine Invasion in irgendein skelettales Element zu beobachten [Zelzer et al. 2001]. Auch eine Expression von VEGF durch hypertrophe Chondrozyten ist dann nicht mehr nachweisbar. Aktuell ist gezeigt worden, dass der transkriptionale Modulator TAZ (Trancriptional Co-Activator with PDZ-Binding Motif) die CBFA1 abhängige Genexpression co-aktiviert und die PPARγ abhängige Genexpression suppremiert [Hong et al. 2005]. Durch Variation der Expression von TAZ in embryonalen Fibroblasten der Maus, in mesenchymalen Stammzellen und in vivo im Zebrafisch, konnte das Gleichgewicht zwischen Osteogenese und Adipogenese verschoben werden. Dies deutet auf eine regulatorische Funktion von TAZ auf die Osteogenese und allgemeiner auf die Stammzelldifferenzierung hin. Die regula- torische Wirkung von Osterix auf die Osteogenese erfolgt stromabwärts von CBFA1. Wie dieser Faktor die Osteoblastendifferenzierung und Funktion reguliert, ist nicht gänzlich geklärt. In Osterix-/- Knock-out Mäusen werden von Zellen, die in der Nachbarschaft von Chondrozyten vorliegen, keine Marker reifer Osteoblasten exprimiert; dafür aber Marker von Chondrozyten [Nakashima et al. 2002]. Dies legt den Schluss nahe, dass Osterix für die Initiation und den Erhalt der osteogenen Linie wichtig ist.

In letzter Zeit hat sich darüber hinaus ein wichtiger Einfluss von β-Catenin auf die Osteogenese herausgestellt. β-Catenin ist ein stromabwärts liegender Mediator des Wnt Signalweges, in dem ein die Transkription regulierender Komplex (TCL/LEF) aus dem T-Cell Factor (TCL) und dem Lymphoid Enhancer-Binding Factor (LEF) formiert wird. Mutationen die das Gen für den Wnt Co-Rezeptor LRP5 (Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 5) inaktivieren, der für die Aktivierung des Wnt Signalling erforderlich ist, führen zu Osteoporose und anderen Erkrankungen [Gong et al. 2001]. Studien, in denen die β-Catenin Expression in verschiedenen Stadien der Osteogenese unterbunden wurde, zeigten einen wichtigen Einfluss auf verschiedene Schritte der Osteogenese [Hu et al. 2005]. Zahlreiche nicht für die Osteogenese spezifische Transkriptionsfaktoren weisen ebenfalls einen Einfluss auf die osteogene Entwicklung auf [Kobayashi & Kronenberg 2005].

1.4.4.1 In vitro Osteogenese

Für die in vitro Osteogenese von mesenchymalen Stamm- und Progenitorzellen ist ein Standard Assay beschrieben worden [Jaiswal et a. 1997; Maniatopoulos et al. 1988; Bellows et al. 1986]. Hier dienen Dexamethason, β-Glycerophosphat und L-Ascorbinsäure-2- phosphat als stimulierende Faktoren. Dexamethason inhibiert in diesem Zusammenhang die Proliferation der MSC [Beresford et al. 1992; Bellows et al. 1990] und fördert deren osteogene Differenzierung [Baylink 1983]. So verläuft die Mineralisierung humaner MSC in Abhängigkeit von Dexamethason [Haynesworth et al. 1992b]. β-Glycerophosphat dient als zusätzliche Phosphatquelle und L-Ascorbinsäure oder L-Ascorbinsäure-2-phosphat während der Kollagensynthese als Co-Faktor zur Hydroxylierung von Prolin und Lysin. Es bewirkt darüber hinaus eine erhöhte Aktivität der Synthese nicht-kollagenöser Poteine der Knochen- matrix [Beresford et al. 1993]. Manchmal wird den Kulturen Kalziumchlorid hinzugegeben, welches als Grundbaustein für die Synthese der anorganischen Knochenmatrix dient.

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 30-34)