Vereinfacht dargestellt, verfolgt das Tissue Engineering den Ansatz, aus Gewebe- biopsaten vitale Zellen zu isolieren, diese in vitro zu expandieren und damit einen Gewebe- defekt zu regenerieren [Ringe et al. 2003]. So sind z.B. für den Gelenkknorpel bereits in der Klinik eingesetzte Verfahren entwickelt worden, bei denen in der ersten Generation des Tissue Engineering autologe artikuläre Chondrozyten isoliert, ex vivo vermehrt und als Zellsuspension in den mit einem Periostlappen verschlossenen Defekt injiziert werden (Autologe Chondrozyten Transplantation; ACT) [Brittberg et al. 1994]. Weiterentwicklungen der zweiten Generation des Tissue Engineering, heute wie die ACT bereits klinischer Alltag, basieren auf Transplantaten aus Biomaterialien und Chondrozyten, um in vitro präformierte Knorpelstrukturen herzustellen und diese zu transplantieren [Erggelet et al. 2003; Sittinger et al. 1996]. Die Biomaterialien bieten anfangs eine mechanische Stabilität und ermöglichen es den Zellen, sich in einer geeigneten räumlichen Umgebung zu entwickeln.

Im Rahmen von Zelltherapien zur Deckung von Defekten mesenchymaler Gewebe, werden aller Voraussicht nach auch Periostzellen und mesenchymale Stammzellen im zunehmen- den Maße klinisch zur Anwendung kommen. Besonders die MSC des Knochenmarks bieten gegenüber verschiedenen differenzierten Zelltypen den Vorteil, dass sie relativ einfach zu isolieren sind, extensiv expandierbar sind und aufgrund ihrer Plastizität auch komplexe Defekte, bei denen mehr als ein Gewebe betroffen ist, regenerieren können [Caplan et al. 2001]. Eine weitere viel diskutierte Eigenschaft von MSC ist deren Hypoimmunogenität [Ryan et al. 2005; Barry et al. 2005]. Diese hat zur Konsequenz, dass MSC allogene Therapiestrategien erlauben, wenn mit autologen MSC kein Erfolg zu erwarten ist. Dies ist potentiell z.B. bei degenerativen Gelenkerkrankungen der Fall. Nach dem derzeitigen Stand der Technik wird nämlich davon ausgegangen, dass das chondrogene Potential autologer MSC bei Arthrose abnimmt, die Zellen folglich für eine Gelenktherapie bei fortgeschrittener Erkrankung nicht geeignet sind [Murphy et al. 2002]. Eine allogene Verwendung von MSC legt auch die Anlage von Zellbanken nahe, um direkt nach Auftreten einer Erkrankung oder Schädigung eines Gewebes die Zelltherapie einleiten zu können.

Die meisten der wenigen klinischen Anwendungen von MSC sind der ersten Generation des Tissue Engineering zuzuordnen und basieren meist auf allogenen Zellen (Tabelle 1.3). Hier ist z.B. eine klinische Studie zu nennen, in der aktuell etwa 50 Patienten nach partieller Ektomie des Meniskus zu dessen Regeneration und zur Prävention von Osteoarthrose allogene MSC in den Gelenkspalt injiziert werden (Osiris Therapeutics Inc.). Diese Anwen- dung beruht auf einer Studie in der Ziege [Murphy et al. 2003]. Nach Induktion der Arthrose durch Resektion der medialen Menisken und des vorderen Kreuzbandes wurde dort einmalig eine MSC/Hyaluronsäure Suspension in den Gelenkspalt injiziert. Im Gegensatz zu den Kontrollen, bildete sich dort am medialen Meniskus Regenerationsgewebe. Auch war im Vergleich zur Kontrollgruppe ein deutlich verlangsamtes Fortschreiten der degenerativen Veränderungen im Sinne einer Arthrose zu beobachten. In einer anderen klinischen Studie, die der zweiten Generation zuzuordnen ist, hat die Gruppe um Wakitani erstmals autologe humane MSC in Knorpeldefekte medialer Femurkondylen transplantiert [Wakitani et al. 2004; 2002]. Die Patienten, die zeitgleich einer hohen tibialen Osteotomie unterzogen wurden, hatten arthrotisch veränderte Kniegelenke. Die MSC wurden vor der Transplantation in einem Kollagengel 3D verpackt, und die Konstrukte wurden mit einem Periostlappen bedeckt. Im Vergleich zur zellfreien Kontrollgruppe zeigte die Probegruppe nach zehn Monaten einen histologisch und arthroskopisch belegbaren verbesserten Gewebeaufbau. Allerdings konnte zwischen beiden Gruppen kein wesentlicher Unterschied in der Besserung der klinischen Symptomatik festgestellt werden.

Auch das Periost kommt nicht nur als Lappen zur Abdeckung von Defekten zur klinischen Anwendung. Periostzellen werden in einem ursprünglich von der Arbeitsgruppe entwickelten Verfahren routinemäßig zum Aufbau von Knochenkonstrukten verwendet [Schmelzeisen et al. 2003]. Dieser Aufbau erfolgt zur Verankerung von Zahnimplantaten im Bodenbereich des

Indikation Quelle/Applikationsweg Resultat Referenz

Osteogenesis Imperfecta Allogene Knochenmark-transplantation/Infusion

# Dichte Knochenformationen unter Einbeziehung der

Spenderzellen # Keine Abstoßungsreaktion

Horwitz et al., 1999

Metachromatische Leuko-

dystrophy und Hurler Syndrom Allogene MSC/Infusion

# Signifikante Verbesserung der

Nervenleitgeschwindigkeit

# Keine Abstoßungsreaktion Koc et al., 2002

Idiopathische aplastische Anämie Allogene MSC/Infusion # Verbesserung des Stromas # Keine Abstoßungsreaktion Fouillard et al., 2003

Meniskusverletzungen und

Arthroseprävention Allogene MSC/Injektion in das Kniegelenk # Klinische Studie läuft Osiris Therapeutics Inc., 2005 Prävention kardialer Dekom-

pensation nach Herzinfarkt Allogene MSC/Infusion # Klinische Studie läuft Osiris Therapeutics Inc., 2005 Akute Graft versus Host Disease Allogene MSC/Infusion # Klinische Studie läuft Osiris Therapeutics Inc., 2005

Critical size Knochendefekt Autologe Knochenmark-zellen/Trägermaterial # Verbesserte Knochenreparatur Quarto et al., 2001

Chondrale Defekte des medialen

Femurkondyls und der Patella Autologe Knochenmarkzellen/ Kollagengel/Periostlappen

# Verbesserter Gewebeaufbau # Klinische Verbesserung nur bei

Patelladefekten Wakitani et al., 2002 und 2004

1. GENERATION DES TISSUE ENGINEERING

2. GENERATION DES TISSUE ENGINEERING

Sinus maxillaris. Hierbei werden autologe Periostzellen zunächst in eine Fibrinmatrix einge- bettet, welche durch ein bioresorbierbares Polymer Vlies gestützt und stabilisiert werden.

Neben dem Differenzierungspotential von mesenchymalen Stamm- und Progenitorzellen ist auch deren Migrationsverhalten von besonderem Interesse. Sehr aktuelle Ansätze des Tissue Engineering der dritten Generation, dem so genannten in situ Tissue Engineering, beschäftigen sich mit der Entwicklung zellfreier Transplantate. Hier werden Biomaterialien in Kombination mit chemotaktisch aktiven Faktoren wie Chemokinen sowie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren kombiniert und in den Defekt implantiert. Die Faktoren ermöglichen eine Rekrutierung geeigneter Zellen zum Ort des Defektes und die dortige Entwicklung der Zellen zum entsprechenden Ersatzgewebe [Sittinger et al. 2004]. Generell entfallen bei der Anwendung solcher Ansätze die den Patienten belastende Gewebebiopsie zur Zell- gewinnung und die aufwendige Zellexpansion unter GMP-Bedingungen. Außerdem können zellfreie Transplantate ähnlich herkömmlicher Arzneimittel produziert und gelagert werden, um eine zeitnahe Behandlung des Patienten zu ermöglichen.

Solche Verfahren sind aktuell noch als Vision zu betrachten, deren Erfolgsaussicht lässt sich aber nach den im Kapitel 1.5 vorgestellten Studien zum Homing, zur Migration und zum Engraftment von mesenchymalen Stammzellen ableiten. Darüber hinaus wurde berichtet, dass nach der Implantation demineralisierter Knochenstücke in das Muskelgewebe, in diesem ektopisch Knochengewebe gebildet wird. Diese Beobachtung wird darauf zurück- geführt, dass Faktoren der Knochenmatrix Zellen aus der Umgebung rekrutieren sowie deren Entwicklung zum Knochen initiiert und reguliert haben [Alden et al. 1999; Reddi 1998]. Weiterhin ist bekannt, dass Knorpelgewebe normal kaum Selbstheilung zeigt. Nur osteo- chondrale Defekte, bei denen ein Kontakt des Knorpels zum Knochenmarkraum besteht, zeigen die Bildung eines meist qualitativ minderwertig differenzierten Ersatzknorpelgewebes. Der Heilungsprozess basiert auf mesenchymalen Stamm- und Progenitorzellen, die aus dem Knochenmark in den Defekt migrieren [Steadman et al. 2001; Shapiro et al. 1993]. Diese Beobachtung wird in chirurgischen Eingriffen bereits zur Therapie von Knorpeldefekten genutzt, in denen durch Knorpelbohrungen (Drilling) oder durch Mikrofrakturierung Verbindungen zwischen dem Knochenmarkraum und dem Knorpel hergestellt werden. Die Synthese der für die Rekrutierung benötigten Faktoren wird mit Thrombozyten in Verbindung gebracht. Dass bei rein chirurgischen Verfahren (hier Drilling oder Mikrofrakturierung) ein Gewebe (hier Knorpel) von im Vergleich mit dem nativen Gewebe geringerer Qualität generiert wird, macht deutlich, dass die Verwendung eines geeigneten Biomaterials sowie von Differenzierung- und von Migrationsfaktoren für die in situ Regeneration zukünftig sehr wichtig sein werden.

2 AUFGABENSTELLUNG

Die Anzahl der Patienten mit degenerativen Erkrankungen oder Verletzungen muskulo- skelettaler Gewebe nimmt aufgrund einer zunehmenden Lebenserwartung und einem verän- derten Freizeitverhalten stetig zu [Brückle 2004]. Neuere biomedizinische Therapieverfahren zur Regeneration solcher Gewebe, wie das Tissue Engineering, sind hier viel versprechend.

Erste klinisch angewendete Verfahren des Tissue Engineering beschränkten sich auf die Isolierung und die Expansion gewebespezifischer Zellen wie Chondrozyten und deren Trans- plantation als Zellsuspension (Kapitel 1.6). In aktuellen klinischen Ansätzen werden die Zellen mit Trägermaterialien kombiniert und in den Defekt transplantiert [Sittinger et al. 1996]. Begründet durch Faktoren wie die begrenzte Expandierbarkeit bereits differenzierter Zellen, die Abnahme ihrer funktionellen Qualität während der in vitro Vermehrung und den Bedarf auch komplexe Defekte, bei denen mehr als ein Gewebe betroffen sind, zu regene- rieren, hat sich das Interesse auf mesenchymale Stamm- und Progenitorzellen gerichtet. So kommen sowohl mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks (MSC; Kapitel 1.2) als auch Progenitorzellen des Periost (Kapitel 1.3) klinisch bereits zur Anwendung (Kapitel 1.6). In jüngster Zeit hat sich gezeigt, dass MSC das Potential besitzen, nach erfolgter systemischer Infusion in das Knochenmark zu Homen oder zu verschiedenen Geweben zu migrieren und sich dort zu integrieren (Engraftment) (Kapitel 1.5). Weitere Befunde weisen darauf hin, dass während akuter Erkrankungen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall, MSC aus dem Knochenmark zum defekten Gewebe rekrutiert werden. Solche Beobachtungen sind die Grundlage für die Erforschung zukünftiger Generationen des Tissue Engineering, nämlich dem in situ Tissue Engineering (Kapitel 1.6).

Die Arbeitshypothese lautet, dass durch den Einsatz von chemotaktischen Faktoren humane MSC in Gebiete eines verletzten oder degenerierten Gewebes rekrutiert werden können, um dort eine gerichtete Regeneration zu ermöglichen. In solchen Therapien werden in die Gewebedefekte zellfreie Biomaterialien implantiert, die chemotaktisch aktive Substan- zen sowie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren enthalten und freisetzen. Die Faktoren gewährleisten eine Rekrutierung humaner MSC zum Ort des Defektes und deren dortige Entwicklung zum entsprechenden Ersatzgewebe [Sittinger et al. 2004]. In situ Tissue Engineering Ansätze sind u.a. deshalb von großem Interesse, weil eine den Patienten belastende Entnahme von Gewebebiopsien und eine zeitaufwendige Zellexpansion unter GMP Bedingungen entfallen.

Die Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit orientierte sich aufgrund der aufgeführten Thematik an der Bearbeitung ausgewählter Fragestellungen, die in vitro initial einer Entwicklung von präklinischen in situ Knorpel Tissue Engineering Ansätzen vorausgehen müssen:

Nachweis der chondrogenen Wirkung für die klinische Anwendung zugelassener Faktoren auf mesenchymale Stammzellen

Der Einfluss für die klinische Anwendung zugelassener Proteine (BMP2) und gelenk- relevanter Substanzen (Hyaluronsäure, autologe Synovialflüssigkeit) auf die in vitro chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks sollte in hochdichten Zellaggregaten untersucht werden, um festzustellen, ob durch Verwendung dieser Faktoren eine Chondrogenese induziert werden kann, und die Faktoren somit für in situ Ansätze zur Knorpelregeneration im präklinischen Modell von Interesse sind. Dieser Nachweis wurde bisher noch nicht erbracht.

Nachweis der Eignung von Chemokinen als Rekrutierungsfaktoren humaner MSC

Es sollte der in vitro Nachweis erbracht werden, dass chemotaktische Zytokine (Chemokine) einen dosisabhängigen chemotaktischen Effekt auf humane mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks ausüben. Somit sollte in dieser Studie primär der Proof of Principle für die Eignung von Chemokinen als Rekrutierungsfaktoren im Rahmen des in situ Tissue Engineering gezeigt werden. Darüber hinaus sollte im Multiwell Chemotaxis Assay die Dosis-Effekt-Kurve ausgewählter Chemokine auf humane MSC aufgenommen werden, um Kandidaten für spätere Tierstudien zu bestimmen. Über einen chemotaktischen Effekt von Chemokinen auf humane MSC war vor dieser Arbeit nicht berichtet worden.

Isolierung und Differenzierung equiner und porciner mesenchymaler Stammzellen für die Etablierung eines Großtiermodells

Im Rahmen der Etablierung eines geeigneten Großtiermodells für das in situ Tissue Engineering sollten mesenchymale Stamm- und Progenitorzellen aus equinen und porcinen Knochenmark isoliert und bezüglich ihres multipotenten Entwicklungspotentials analysiert werden. Das Pferd war hier von Interesse, weil es vor der Arbeit Berichte über das Vorliegen equiner Progenitorzellen mit chondrogenem Potential gab [Fortier et al. 1998] und darüber hinaus bekannt ist, dass eine bei Pferden auftretende Arthrose einen ähnlichen Verlauf wie beim Menschen zeigt und somit Therapien die sich beim Pferd bewähren, potentiell auf den Menschen übertragbar sind. Zu MSC aus dem Schwein lagen vor der Arbeit noch keine Literaturdaten vor. Das Schwein ist im Tissue Engineering aber ein etablierter Modellorganismus und somit neben dem Pferd ein weiteres potentielles präklinisches Großtiermodell für die Stammzellforschung und für in situ Therapien. Die Evaluierung des multipotenten Potentials von Zellen beider Spezies erfolgte in Standard Assays [Pittenger et al. 1999], die routinemäßig auch zur Differenzierung humaner MSC verwendet werden.

Nachweis eines MSC-ähnlichen Charakters humaner Periostzellen

Obwohl sich die Arbeitshypothese auf mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks bezog, sollten auch aus dem Periost Progenitorzellen isoliert und bezüglich ihres Wachstumspotentials, ihrer multipotenten Entwicklung, ihrer Expression (Mikroarray Analyse) und Präsentation (FACS Analyse) von MSC-relevanten Markern und ihres chemotaktischen Verhaltens mit humanen MSC verglichen werden. Hier galt es erstmals zu zeigen, ob Periostzellen ein MSC-ähnliches Potential aufweisen und darüber hinaus den Proof of Principle zu erbringen, dass auch diese Zellen für in situ Tissue Engineering Ansätze von Interesse sind.

3 METHODEN

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 38-43)