Hyaluronsäure und Synovialflüssigkeit induzierte Chondrogenese

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5.4 Equine Mesenchymale Progenitorzellen

5.4.3 Hyaluronsäure und Synovialflüssigkeit induzierte Chondrogenese

Das Pferd wurde u.a. deshalb als zweites mögliches Großtiermodell ausgewählt, weil eine bei Pferden auftretende Arthrose einen ähnlichen Verlauf wie beim Menschen aufweist und somit Therapien, die sich beim Pferd bewähren, potentiell auf den Menschen übertragbar sind [Jeffcott et al. 1982]. Darum sollte hinsichtlich der equinen Progenitorzellen vor allem der Einfluss von gelenkrelevanten Faktoren, nämlich von Hyaluronsäure und von autologer Synovialflüssigkeit, auf die chondrogene Entwicklung untersucht werden.

In den letzten Jahren konnte ein chondrogenes Potential equiner Progenitorzellen bereits gezeigt werden. So wurde in Monolayerkulturen mit TGFβ1 [Worster et al. 2000] und in Fibrinmatrizes mit IGF1 eine chondrogene Entwicklung ausgelöst [Worster et al. 2001]. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die equinen Progenitorzellen sich auch im hochdichten Kultursystem in die chondrogene Richtung entwickeln. Diese konnte mit TGFβ1, den Hyaluronsäuren Hylartil und Ostenil sowie mit autologer Synovialflüssigkeit induziert werden. Die Wichtigkeit hochdichter Zellaggregate sowie der Einfluss von TGFβ1 und von Dexamethason auf die chondrogene Entwicklung wurden bereits diskutiert. Die nur mit Dexamethason behandelten Kontrollen zeigten auch nach 26 Tagen kein Sekretion von Kollagen Typ II oder Alcianblau gefärbter Proteoglycane. Die mit TGFβ1 stimulierten Kulturen zeigten im Vergleich zu den mit Hyaluronsäure oder mit Synovialflüssigkeit behan- delten Kulturen die am stärksten ausgeprägte Chondrogenese.

In früheren Studien wurde gezeigt, dass Hyaluronsäure die Aggregation von Zellen der Extremitätenanlagen fördert und deren Chondrogenese induziert [Maleski & Knudson 1996b; Kujawa & Caplan 1986]. Aus diesen Studien ist bekannt, dass der Effekt vom Molekulargewicht (MW) und der Konzentration der Hyaluronsäure abhängt. Hier erwies sich ein MW zwischen 2x105 und 4x105 Da als vorteilhaft, wohingegen ein MW von größer als 1x106 Da die Chondrogenese inhibiert, indem es die Aggregation von Zellen unterbindet. Die in dieser Arbeit getestete Hyaluronsäure Hylartil hatte ein MW von 2x106 Da und Ostenil ein MW von 3x106 Da. Diese wurden trotz ihres hohen Molekulargewichtes getestet, da Ostenil für humane klinische Anwendungen und Hylartil für tiermedizinische Anwendung zugelassen ist. Beide Hyaluronsäuren konnten trotz ihres hohen Molekulargewichtes eine Chondro- genese induzieren, was wohl auf das verwendete Kultursystem zurückzuführen ist. Dieses fördert durch die Pelletierung Zellaggregationen, warum das hohe Molekulargewicht von Hylartil und Ostenil potentiell nicht mehr von großer Bedeutung ist. Der chondrogene Effekt beider Hyaluronsäuren beruht wahrscheinlich zumindest partiell auf der Wechselwirkung dieser mit ihrem Rezeptor CD44, der von den mesenchymalen Stammzellen stark präsentiert wird [Pittenger et al. 1999]. Diese Annahme beruht darauf, dass in zurückliegenden Studien

solche Interaktionen im Rahmen der embryonalen Knorpelentwicklung beschrieben worden sind [Ishida et al. 1997; Maleski & Knudson 1996b]. Insgesamt wurden nach 26 Tagen in den mit Hylartil oder mit Ostenil stimulierten Kulturen im Vergleich zu den mit TGFβ1 stimulierten Kulturen weniger Alcianblau gefärbte Proteoglycane sekretiert, was in kleineren Pellets resul- tierte. Ein synergistischer Effekt in den mit Hylartil und TGFβ1 bzw. in den mit Ostenil und TGFβ1 stimulierten Kulturen, war nicht zu beobachten. Es muss vermutet werden, dass beide Hyaluronsäuren in Kombination mit TGFβ1 potentiell die Wachstumsrate der Zellen hemmen, da die Pelletgröße dieser Ansätze kleiner war, als die der nur mit TGFβ1 behan- delten hochdichten Zellaggregate.

Von autologer Synovialflüssigkeit war bekannt, dass diese in vitro und auch in vivo einen chondrogenen Effekt auf Zellen des Perichondriums ausübt [Skoog et al. 1990]. Dieser Effekt wurde auch in Zellen des Mesenchyms der Extremitätenanlagen beobachtet [Rodrigo et al. 1995]. In dieser Arbeit konnte ein solcher Effekt im hochdichten Zellkultursystem gezeigt werden. Konzentrationen von 5%, 10% und 50% autologer Synovialflüssigkeit (Kapitel 4.9.3.3) resultierten in Pellets, die größer als die mit Hyaluronsäure stimulierten waren. Dies weist darauf hin, dass Synovialflüssigkeit neben Hyaluronsäure noch andere chondrogene Faktoren beinhaltet. Hier ist TGFβ1 zu nennen [Okazaki et al. 2001], aber auch z.B. das Hormon Prolactin, dass das Wachstums und die chondrogene Differenzierung humaner MSC moduliert [Ogueta et al. 2002].

Obwohl der generierte Knorpel sicher noch nicht nativem hyalinen Gelenkknorpel ent- spricht, sind die Ergebnisse auch darum viel versprechend, weil sich hier die natürliche Um- gebung im Gelenk als vorteilhaft für die chondrogene Differenzierung von MSC gezeigt hat. Somit sind sowohl die für die klinische Anwendung zugelassene Hyaluronsäure als auch die autologe Synovialflüssigkeit für in situ Ansätze zur Knorpelregeneration im präklinischen Modell von Interesse. Im Hinblick auf eine klinische Anwendung von MSC, unabhängig davon ob in in situ oder in herkömmlichen Tissue Engineering Ansätzen, muss berücksichtigt werden, dass die meisten Patienten im fortgeschrittenen Alter sind und oft an chronischen degenerativen Gelenkerkrankungen leiden. Darum wird aktuell der Einfluss von patholo- gischer Synovialflüssigkeit auf MSC genauer untersucht. Von Mesenchymzellen der Extremi- tätenanlagen wurde berichtet, dass Synovialflüssigkeit aus chronisch verletzten Gelenken zu einer Inhibition der Chondrogenese führt [Skoog et al. 1999].

Es lässt sich zusammenfassen, dass nach dem Protokoll zur Isolierung equiner mesenchy- maler Progenitorzellen, Zellen mit osteochondrogenen Potential isoliert werden konnten. Da unter den gewählten Bedingungen keine Adipogenese induziert werden konnte, sollten diese bis zu deren Nachweis nicht als mesenchymale Stammzellen bezeichnet werden.

Insgesamt konnten in dieser Arbeit im Rahmen der Etablierung eines geeigneten Großtier- modells für das in situ Tissue Engineering, mesenchymale Stamm- und Progenitorzellen aus dem equinen und porcinen Knochenmark isoliert und charakterisiert werden. Nach dem aktuellen Stand der Literatur, repräsentiert das Schwein das bessere Modell für Migrationsstudien, während das Pferd ein besseres Modell für die Erforschung degenerativer Erkrankungen darstellt.

6 ZUSAMMENFASSUNG

Während der vorliegenden Arbeit wurde das Differenzierungs- und Migrationspotential von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks (MSC) und von Periostzellen analysiert. Hierbei standen Fragestellungen im Vordergrund, die vor der Durchführung von präklini- schen in situ Knorpel Tissue Engineering Studien in vitro untersucht werden müssen.

Es konnten aus Knochenmarkaspiraten mittels Dichtegradientenzentrifugation routine- mäßig humane MSC isoliert und expandiert werden. In der FACS Analyse zeigten diese über vier Passagen das in der Literatur beschriebene Profil von Oberflächenmarkern (ALCAM+, SH2+, SH3+, CD14-, CD34-, CD44+, CD45-, CD90+). Die MSC konnten zur Überprüfung ihres multipotenten Stammzellcharakters reproduzierbar in die adipogene, die chondrogene und die osteogene Richtung differenziert werden. Der Nachweis der in Standard Assays durch- geführten Differenzierung erfolgte histochemisch und immunhistochemisch.

In hochdichten Zellaggregaten konnte erstmals der chondrogene Effekt von rekombinantem BMP2 auf humane MSC gezeigt werden. Die Chondrogenese wurde histo- chemisch mittels Alcianblau Färbung von Proteoglycanen und immunhistochemisch mittels Kollagen Typ II Färbung nachgewiesen. Darüber hinaus bestätigte die Genexpressions- analyse von Markergenen der Knorpelmatrix, wie Kollagen Typ II und Typ IX, Aggrecan, COMP und Cartilage Link Protein, eine chondrogene Entwicklung. Mittels von Kossa Färbung zum Nachweis der Bildung einer mineralisierten Matrix sowie mittels real-time RT- PCR des osteogenen Markers Osteocalcin und des adipogenen Markers aP2 konnte demonstriert werden, dass parallel zur chondrogenen Entwicklung keine osteo- oder adipogene Differenzierung stattgefunden hat. Mit der ebenfalls durchgeführten Kollagen Typ X Färbung war keine Formation hypertrophen Knorpels erkennbar. Insgesamt konnte somit gezeigt werden, dass für die klinische Anwendung zugelassenes BMP2 im Rahmen von in situ Ansätzen zur Knorpelregeneration im präklinischen Modell von Interesse ist.

In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals eine Expression von Chemokinrezeptoren durch humane MSC nachgewiesen und deren komplettes Chemokinrezeptor Expressionsprofil erhoben werden. Mittels real-time RT-PCR und spezifischer Antikörper ließen sich die Rezeptoren CCR1, CCR2, CCR4, CCR7-10, CXCR1-6, CX3CR und XCR nachweisen. Im während der Arbeit etablierten 96-Well Chemotaxis Assay konnte darüber hinaus demonstriert werden, dass die Chemokine CXCL8/IL8 und CXCL12/SDF1α einen dosis- abhängigen chemotaktischen Effekt auf humane MSC aufweisen. Dies ist als Proof of Principle für die Eignung von Chemokinen als Rekrutierungsfaktoren humaner MSC zu werten. Der Chemotaxis Assay erlaubt es, zukünftig im Hochdurchsatz weitere Kandidaten für Rekrutierungsstudien im Tiermodell zu selektieren.

Hinsichtlich der Etablierung eines Großtiermodells für das in situ Tissue Engineering, konnten erstmals MSC aus dem Schwein isoliert werden und diese vergleichbar zu humanen MSC, in die adipo-, osteo- und chondrogene Richtung differenziert werden. Dies wurde histochemisch, immunhistochemisch und mittels semiquantitativer RT-PCR der adipogenen Markergene PPARγ2 und aP2 sowie der osteogenen Markergene Kollagen Typ I, Osteocalcin, Osteonectin und Osteopontin nachgewiesen. Aufgrund der hier gezeigten

Ähnlichkeit zu den humanen MSC repräsentiert das Schwein insgesamt ein viel ver- sprechendes präklinisches Großtiermodell für das in situ Tissue Engineering.

Im Rahmen der Etablierung eines weiteren Großtiermodells wurden auch mesenchymale Progenitorzellen des Pferds adipo- osteo-, und chondrogen stimuliert. Hier zeigte sich nur ein osteochondrogenes Entwicklungspotential, während eine adipogene Entwicklung weder licht- mikroskopisch noch mittels Oil Red O Färbung von Lipiden nachweisbar war. Weil das Pferd als Großtiermodell für die Erforschung degenerativer Erkrankungen dient, wurde in hoch- dichten Zellaggregaten der chondrogene Effekt von Faktoren des natürlichen Gelenkmilieus analysiert und erstmals nachgewiesen. Die für klinische Anwendungen zugelassene Hyaluronsäure Ostenil sowie autologe Synovialflüssigkeit konnten im gewählten System eine chondrogene Entwicklung auslösen. Der Nachweis erfolgte mittels Alcianblau und Kollagen Typ II Färbung. Insgesamt konnte somit gezeigt werden, dass sowohl Hyaluronsäure als auch autologe Synovialflüssigkeit für in situ Ansätze zur Knorpelregeneration im präklini- schen Modell von Interesse sind. Das Pferd repräsentiert hierfür ein Modellorganismus.

Es wurden in dieser Arbeit auch Progenitorzellen aus dem Periost des Mastoidknochens isoliert und expandiert. Die mittels enzymatischem Verdau isolierten Zellen zeigten ein mit den humanen MSC vergleichbares Vermehrungspotential und in der FACS Analyse ein MSC-ähnliches Profil an präsentierten Oberflächenantigenen (ALCAM+, SH2+, SH3+, CD14-, CD34-, CD44+). Allerdings waren die Periostzellen im Unterschied zu den MSC CD45positiv. Mittels genomweiter Affymetrix Mikroarray Analyse wurde das gesamte Genexpressionsprofil von humanen Periostzellen aufgenommen. Es wurden kaum embryonale oder hämatopoeti- sche Stammzellmarker detektiert, während Periostzellen verschiedene Marker mesen- chymaler Stammzellen exprimierten.

Die Periostzellen zeigten zudem ein multipotentes Differenzierungspotential. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals die adipogene Entwicklung dieser Zellen auf zellulärer und molekularer Ebene demonstriert werden. Der Nachweis erfolgte histochemisch mittels Oil Red O Färbung und auf mRNA Ebene mittels real-time RT-PCR adipogener Markergene wie aP2 und APM1. Wie auch für die humanen MSC konnte zudem erstmalig die Expression von Chemokinrezeptoren und darüber hinaus das gesamte Chemokinrezeptor Expressionsprofil von Periostzellen analysiert werden. Dieses war dem Profil humaner MSC sehr ähnlich. Auch ein dosisabhängiger migratorischer Effekt eines Chemokins auf Periostzellen, nämlich von CXCL12/SFD1α, konnte erstmals nachgewiesen werden. Es kann festgehalten werden, dass die in dieser Arbeit durchgeführten Studien einen MSC-ähnlichen Charakter der Periostzellen demonstrierten. Die Resultate motivieren zu weiteren in vivo Studien zum Differenzierungs- und Migrationspotential von Periostzellen im Rahmen des in situ Tissue Engineering. Das Proof of Principle der Eignung von Chemokinen als Rekrutierungsfaktor humaner Periostzellen wurde hier erbracht.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Ergebnisse zum Differenzierungs- potential der für die klinische Anwendung zugelassenen Faktoren BMP2, Hyaluronsäure und autologe Synovialflüssigkeit für die in situ Knorpelregeneration viel versprechend sind. Die Wirkung dieser Faktoren und auch die von Chemokinen muß in vivo eingehender analysiert werden. Hierfür stehen mit dem Schwein und mit dem Pferd zwei potentiell gut geeignete präklinische Großtiermodelle zur Verfügung.

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