Die innere Kambiumschicht und die äußere faserige Schicht des Periost umhüllen als nahezu kontinuierliches Gewebe sowohl die während der desmalen- als auch die im Rahmen der endochondralen Ossifikation gebildeten Knochen (Kapitel 1.3). Der Mastoid- knochen wird durch endochondrale Ossifikation gebildet. Aufgrund ihres osteochondrogenen Differenzierungspotentials sind die im Periost residierenden Progenitorzellen (Periostzellen) oftmals als mesenchymale Stammzellen bezeichnet worden. Dies konnte bisher aber nicht nachgewiesen werden. So mangelt es an systematischen Untersuchungen, wie ähnlich sich die MSC des Knochenmarks und die Periostzellen sind und ob letztere sich wie MSC in die verschiedenen Bindegewebszellen entwickeln. Untersuchungen hierzu sollten in dieser Arbeit einleitend durchgeführt werden.

Obwohl Periostzellen im Vergleich zu den MSC des Knochenmarks auf zellulärer und molekularer bisher nur wenig charakterisiert worden sind, wurden diese oder Periost als ganzes, bereits in mehreren 1000 Operationen zum Knochen- und Knorpelersatz trans- plantiert (Kapitel 1.6).

Die hier verwendeten humanen Periostzellen wurden aus Biopsaten (etwa 0,5cm2 groß) des Mastoids gewonnen, die an der Charité-Universitätsmedizin Berlin (HNO-Klinik, Abteilung für Otorhinolaryngologie) im Rahmen von operativen Eingriffen am Mittelohr ent- nommen worden sind. Teile der folgenden Ergebnisse sind aktuell zur Veröffentlichung eingereicht.

4.4.1 Isolierung von humanen Periostzellen

Zu Beginn dieser Arbeit lag bereits ein Protokoll zur Isolierung primärer humaner Periost- zellen vor. Dieses basierte auf Caplan [Caplan et al. 1983], wurde aber bereits vor der vorliegenden Arbeit in der Arbeitsgruppe Tissue Engineering in weiten Teilen modifiziert. Hierbei erfolgt im Gegensatz zur Isolierung humaner MSC zunächst ein enzymatischer Verdau der Periost Biopsate. Auch bei dieser Methodik wird, wie bei den MSC (Kapitel 3.1.1), vom Prinzip der selektiven Adhärenz Gebrauch gemacht, nach dem nicht adhärierende Zellen während der alle 2-3 Tage erfolgenden Medienwechsel langsam entfernt werden (Abbildung 4.21). Alle Versuche in dieser Arbeit konnten in Medium, supple- mentiert mit allogenen Serum, durchgeführt werden. Ein wichtiges Merkmal zur Beurteilung der Kulturen war deren spindelförmig fibroblastoides Erscheinungsbild. Solche Zellkulturen führten wie bei den MSC, fast immer zu homogenen Primärkulturen, welche für die Subkulti- vierung über mehrere Passagen und somit für eine extensive Zellexpansion geeignet waren.

4.4.2 Exemplarischer Kulturverlauf humaner Periostzellen

Für alle im Folgenden beschriebenen Versuche zur in vitro Zellkultur primärer humaner Periostzellen des Mastoids, wurden jeweils frisch isolierte Zellen in DME-Medium/Ham´s F12, supplementiert mit allogenen Serum, verwendet. Nach erfolgtem enzymatischen Verdau der Biopsate und den weiteren Isolationsschritten (Kapitel 3.1.2), wurden alle Zellen in ein Well einer 6-Well Platte mit Primaria Oberfläche ausgesät. Die Zellen hatten je nach Adhärenzverhalten 5-7 Tage Zeit zu adhärieren, bevor der erste Mediumwechsel mit Entfernung der nicht adhärierten Zellen erfolgte.

Nach 2-4 Tagen waren in den Kulturen neben vielen Erythrozyten (Abbildung 4.21 A) lichtmikroskopisch oftmals bereits vereinzelte Zellen zu erkennen, die sich an der Oberfläche des Gefäßbodens abgesetzt haben (Abbildung 4.21 B). Diese zeigten das typische Erscheinungsbild von Periostzellen, nämlich eine schmal und langgestreckte fibroblastoide Morphologie. Während des weiteren Kulturverlaufs waren wie bereits für MSC beschrieben (Kapitel 4.1.2), Zellkolonien mit variierender Zahl an Periostzellen zu beobachten. Wenn die ersten dieser Kolonien nach etwa 10-14 Tagen konfluent wuchsen (Abbildung 4.21 C), wurden die Periostzellen trypsiniert und alle Zellen in eine Kulturflasche mit 175cm2 Primaria- oberfläche überführt, wobei die Aussaatdichte variierte. In allen weiteren Passagen wurden 6.000 Zellen/cm2 Oberfläche ausgesät. Im Gegensatz zu Kulturen humaner MSC, waren mikroskopisch in den Primärkulturen und in höheren Zellpassagen (Abbildung 4.21 D; Passage 3) neben den typischen spindelförmigen Zellen kaum Zellen mit breiter, voluminö- ser Morphologie zu beobachten.

Um das Expansionspotential von humanen Periostzellen abschätzen zu können, wurden diese bis zur Passage sieben expandiert und die Zellzahl jeweils bei etwa 90% Konfluenz bestimmt (Abbildung 4.22). Wie zu erwarten, waren die Zellzahlen stark vom Donor (n=3) abhängig. Dennoch ist der Abbildung 4.22 zu entnehmen, dass aus Primärkulturen mit weniger als 100 Zellen Einsaat bis zur ersten Passage ca. bis zu 4x105 Zellen auswuchsen. Diese konnten im Vergleich zur P1 in der P3 etwa um den Faktor 32 (ca. 13x106 Zellen) und in der P7 etwa um den Faktor 6.000 (ca. 2,5x109 Zellen) expandiert werden. Dies entspricht in etwa dem für humane MSC beschriebenen Wachstumspotential [Haynesworth et al. 1992b]. In der Abbildung 4.22 B ist die Zahl der in der Passage Pn erhaltenen Periostzellen dividiert durch die in der Passage Pn-1 erhaltenen Zellen aufgetragen (Expansion pro

Abbildung 4.21: Repräsentativer Kulturverlauf primärer humaner Periostzellen. (A) Tag 3, (B) Tag 4, (C) Tag 14, (D) Passage 3.

Passage; linke Achse). Es wird deutlich, dass über den Kulturverlauf bis zur P7 eine Abnahme der proliferativen Aktivität erfolgte. Durch die Multiplikation von Pn und Pn-1 (Abbil- dung 4.22 B; rechte Achse) wird der Expansionsfaktor von Passage zu Passage aufgezeigt.

4.4.3 Osteochondrogenes Differenzierungspotential von Periostzellen

Das osteochondrogene Differenzierungspotential von humanen Periostzellen ist vielfach beschrieben worden (Kapitel 1.3). In dieser Arbeit wurden entsprechende Differenzierungen nur durchgeführt, um das Vorliegen von Progenitorzellen des Periost zu verifizieren.

Die chondrogene Differenzierung wurde routinemäßig mit TGFβ3 stimuliert [Johnstone et al. 1998]. Dabei waren am Tag sieben noch keine sauren, sulfatreichen Proteoglycane mittels Alcianblau Färbung nachweisbar (Abbildung 4.23 A). Auch war zu diesem Zeitpunkt keine Sekretion von knorpeltypischem Kollagen Typ II detektierbar (Abbildung 4.23 B). Bereits zu diesem Zeitpunkt wiesen die hochdichten Pelletkulturen wie die MSC Pellets aber eine kompakte, stabile Struktur auf (Kapitel 4.2.1).

1,00E-02 1,00E-01 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1 2 3 4 5 6 7 PC 1 PC 2 PC 3

Passage [P

n

]

Zellzahl

[x10

6

]

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 2 3 4 5 6 7 0,00E+00 1,00E+03 2,00E+03 3,00E+03 4,00E+03 5,00E+03 6,00E+03

Expansion / Passage Expansion / Kultur

Passage [P

n

]

B

Expansion / Passage

(

P

n

/P

n -1

)

Expansion

/

Kultur

(

P

n

xP

n -1

)

A

Abbildung 4.22: Humane Periostzellen dreier Donoren, expandiert bis zur Passage 7.

(A) Zellzahlen, die in den Passagen bei etwa 90% Konfluenz ermittelt wurden. (B) linke Achse: Abnahme der proliferativen Aktivität (Pn/Pn-1); rechte Achse:

Expansionsfaktor (PnxPn-1) humaner Periostzellen. Da die Zellzahlen pro Kultur

und Passage nur einmal bestimmt wurden, wird keine Standardabweichung angegeben.

Am Tag 28 war in den stimulierten Kulturen sehr deutlich eine Bildung von Proteoglycanen und weniger schwach ausgeprägt, auch eine Bildung von Kollagen Typ II zu beobachten (Abbildung 4.23 C, D). Im Vergleich zu den humanen mesenchymalen Stammzellen (Kapitel 4.2), zeigten die Periostzellen eine schwächer ausgeprägte Chondrogenese.

Zur osteogenen Differenzierung wurden die Periostzellen in Gegenwart von Dexa- methason, Kalziumchlorid, L-Ascorbinsäure-2-phosphat und β-Glycerophosphat kultiviert [Jaiswal et al. 1997]. Der Nachweis erfolgte durch Messung der zunehmenden ALP Aktivität (Abbildung 4.24 A, C, E, G) und der Formation einer mineralisierten Matrix (Abbildung 4.24 B, D, F, H).

Abbildung 4.23: Chondrogene Differenzierung humaner Periostzellen des Mastoids. Passage 4. Alcianblau (A, C, E) und Kollagen Typ II (B, D, F) Färbung zum Nachweis der chondrogenen Induktion durch TGFβ3.

Abbildung 4.24: Osteogene Differenzierung humaner Periostzellen des Mastoids. Passage 4. Alkalische Phosphatase (A, C, E, G) und von Kossa (B, D, F, H) Färbung zum Nachweis der osteogenen Induktion.

(A, B) stimuliert, Tag 3, (C, D) stimuliert, Tag 6, (E, F) stimuliert, Tag 9 (G, H) Kontrollen am Tag 9.

Während der Osteogenese erschienen die Zellkulturen konfluent und es bildeten sich mehrschichtige Cluster mineralisierter Matrix. Die ALP Färbung demonstrierte bereits am Tag drei (Abbildung 4.24 A) eine höhere Aktivität dieses Enzyms im Vergleich zu den Kontrollen am Tag 9 (Abbildung 4.24 G). Am Tag neun war die ALP Färbung teilweise von der neu formierten Knochenmatrix überdeckt (Abbildung 4.24 E). Mittels von Kossa Färbung war reproduzierbar bereits am Tag sechs, manchmal schon am Tag drei, die Formierung einer mineralisierten Matrix nachweisbar. In Kulturen von MSC des Knochenmarks war eine entsprechende Matrix meist erst nach drei Wochen zu beobachten. Diese Aussage weist auf ein im Vergleich zu den MSC größeres osteogenes Potential der ursprünglich als osteogene Progenitorzellen betrachteten Periostzellen hin. Am Tag neun war fast die gesamte Kultur- oberfläche von einer mineralisierten Matrix überlagert (Abbildung 4.24 F). Die Kontroll- kulturen zeigten am Tag neun keine Formation einer solchen Matrix (Abbildung 4.24 H).

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 92-97)