3.4.1 Histologische Färbetechniken zum Nachweis der Differenzierung

3.4.1.1 Oil Red O Färbung (Adipozytenfärbung)

Oil Red O ist ein Farbstoff, der im Lipidanteil von Geweben abgelagert wird. In der Vital- färbung mit Oil Red O erscheinen neutrale Fette rot. Somit lassen sich eine zunehmende Anzahl wie auch die Vergrößerung der im Zytoplasma eingelagerten Fetttröpfchen über die Kulturdauer erkennen.

Oil Red O Stammlösung

0,5g Oil Red O in 100ml Isopropanol p.A.

Oil Red O Färbelösung

Durchführung

Der Zellrasen wurde nach dem Absaugen des Kulturmediums 30min. mit der Färbelösung überschichtet und bei RT inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS konnte man im Lichtmikroskop rot gefärbte Fetttröpfchen erkennen. Die Färbung blieb nur über einen kurzen Zeitraum stabil.

3.4.1.2 Kryoschnitte (für Färbungen zum Nachweis der Chondrogenese)

Die in Einbettschälchen (Tissue-Tek-Cryomold) überführten Zellpellets wurden blasenfrei mit einer carbowachshaltigen Lösung (Tissue-Tek-O.C.T Compound) überschichtet und durch wiederholtes, langsames Eintauchen des Schälchens in den flüssigen Stickstoff von außen nach innen eingefroren.

Die so behandelten Pellets ließen sich bei -800C über einen längeren Zeitraum lagern. Das Schneiden der Kryoblöcke erfolgte am Kryostaten. Die 6µm dicken Schnitte wurden 24h bei RT getrocknet und entweder gleich gefärbt oder in kalten Methanol/Aceton (1/1 v/v) fixiert für einen kurzen Zeitraum bei-20° gelagert.

3.4.1.3 Alcianblau Färbung (Chondrozytenfärbung)

Mit Alcianblau, pH 2,5 wird die Knorpelgrundsubstanz, saures, sulfatreiches Proteoglycan, angefärbt. Die Zellkerne werden durch eine Gegenfärbung mit Kernechtrot rot dargestellt.

Alcianblau Färbelösung

1% (w/v) Alcianblau 8GX in 3% Essigsäure, pH 2,5

Kernechtrot Färbelösung

5g Aluminiumsulfat in 100ml H2O erhitzen, 0,1g Kernechtrot einrühren, erkalten lassen und filtrieren

Durchführung

Die Kryoschnitte wurden zunächst für 3min. mit 3% Essigsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, dann 30min. mit der Alcianblau Färbelösung überschichtet, anschließend mehr- mals mit 3% Essigsäure und mit H2O gespült. Es folgte die Kernfärbung mit Kernechtrot für 4min. und ein mehrmaliges Spülen mit Aqua dest. Dann folgte ein Entwässern mittels aufsteigender Alkoholreihe mit 96%- und 100%- EtOH. Im letzten Schritt wurden die Schnitte um den Alkohol zu entfernen, in Xylol gestellt und mit Kanadabalsam eingedeckt. Die auf diese Weise eingedeckten Schnitte konnten bis zur Dokumentation aufbewahrt werden.

3.4.1.4 Von Kossa Färbung an Kryoschnitten (Nachweis der Mineralisierung)

Mit der von Kossa Färbung wird die Bildung einer mineralisierten Matrix nachgewiesen. Das in Carbonaten und Phosphaten der Matrix gebundene ungelöste Kalzium wird durch Silberionen ausgetauscht und zu metallischem Silber reduziert. Kalziumhaltige Zonen färben sich braun-schwarz und lassen so deutlich den Grad der Mineralisierung erkennen.

Silbernitratlösung

5% AgNO3 in H2O

Natriumcarbonatlösung

5g Na2CO3, 200µl Formaldehyd (37%ig) in 100ml H2O

Kernechtrot Färbelösung

5g Aluminiumsulfat in 100ml H2O erhitzen, 0,1g Kernechtrot einrühren, erkalten lassen und filtrieren

Durchführung

Bei der von Kossa Färbung wurden die Kryoschnitte 5min. mit kaltem Aceton/Methanol (1:1 v/v) fixiert, mit H2O gewaschen und für 30min. im Dunklen mit einer 5% Silbernitratlösung inkubiert. Nach erneutem Spülen mit Aqua dest. erfolgte die Fixierung mit einer Natrium- carbonatlösung für 7min. (Reduktion der Silberionen zu elementarem Silber). Nach mehrmaligem Auswaschen der Fixierlösung mit H2O wurden die Kerne 10min. mit Kernechtrot angefärbt. Die gründlich mit H2O gespülten Schnitte wurden anschließend 20min. in 96% EtOH und 10min. in 100% ETOH entwässert. Die Schnitte wurden mit Kanadabalsam eingedeckt.

3.4.1.5 Fixieren von Zellen (für Färbungen zum Nachweis der Osteogenese)

Zum Fixieren der Zellen wurde das Kulturmedium vollständig abgesaugt, der Zellrasen mit warmem PBS gewaschen und anschließend mit Methanol p.A. (-200C) überschichtet. Die zu fixierenden Zellen wurden für 20min. bei -200C inkubiert, die Fixierlösung abgesaugt und die fixierten Zellen dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Die mit sterilem Wasser überschich- teten Zellen konnten dann bis zur Färbung bei 40C gelagert werden.

3.4.1.6 Alkalische Phosphatase Färbung (Osteoblastenfärbung)

Alkalische Phosphatase ist ein Oberflächenenzym, das bei Osteoblasten eine erhöhte Aktivität aufweist. Die Aktivität wurde in diesem Nachweis über die Umsetzung eines Substratersatzstoffes zu einem dunklen Niederschlag detektiert.

Färbelösung

NBT/BCIP Tabletten, 1 Tablette in 10ml H2O

Durchführung

Die mit Methanol fixierten Zellen wurden dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Zum Nachweis der zellulären ALP wurde der Zellrasen im Dunklen für 10min. mit der Färbelösung inkubiert. Die zelluläre ALP katalysiert eine Dephosphorylierung von 5-Brom-4-chlor-3-indoyl- phosphat (BCIP). Die Umwandlung in einen unlöslichen dunklen Niederschlag, der visuell wahrgenommen werden kann, erfolgt durch Oxidation durch Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) als Oxidationsmittel. Die gefärbten Zellen konnten bis zur Dokumentation über mehrere Wochen bei 40C gelagert werden.

3.4.1.7 Von Kossa Färbung in Monolayerkulturen

Mit der von Kossa Färbung wird eine mineralisierte Matrix, wie sie beim Knochen vorliegt, nachgewiesen. Das Prinzip der Färbung wurde bereits im Kapitel 3.4.1.4 beschrieben.

Silbernitratlösung

5% AgNO3 in H2O

Natriumcarbonatlösung

5g Na2CO3, 200µl Formaldehyd (37%ig) in 100ml H2O

Durchführung

Die mit Methanol fixierten Zellen wurden dreimal mit sterilem Wasser gewaschen und für 30min. unter Lichtabschluss mit Silbernitratlösung inkubiert, anschließend gründlich mit sterilem Wasser gewaschen und mit einer Reduktionslösung (Natriumcarbonatlösung) bedeckt. Die Reduktion erfolgte innerhalb weniger Minuten und wurde durch erneutes Waschen mit Wasser gestoppt. Die von Kossa gefärbten Zellen konnten über mehrere Wochen bei 40C aufbewahrt werden.

3.4.2 Immunhistochemische Färbungen

Bei immunhistochemischen Methoden werden Antigene mit spezifischen Antikörpern, den Primärantikörpern, sichtbar gemacht. Als Detektionssystem wurde das DAKO EnVision System gewählt. Hier wird der primäre- durch einen sekundären Antikörper nachgewiesen. Letzterer liegt kovalent an ein Dextranpolymer gebunden vor. Ein dritter Bestandteil des als EnVision Konjugat bezeichneten Komplexes ist das Enzym Meerrettichperoxidase. Dieses katalysiert die Oxidation von 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) zu einem roten Farbprodukt.

Durchführung

Die aufgetauten Kryoschnitte wurden nach kurzer Trocknung bei RT 5min. mit kaltem 1:1 Methanol/Aceton-Gemisch fixiert und für 30min. bei 37° getrocknet. Um ein Verlaufen der Reagenzien zu vermeiden, wurden die Schnitte mit einem DAKO-Pen umrandet. Als Monolayer gewachsene Zellen wurden in 8-Well Chamberslides kultiviert. Im ersten Schritt wurde das Medium aus den Kammern abgesaugt, die Zellen 2x mit PBS Puffer gewaschen und wie die Kryoschnitte fixiert und getrocknet. Alle folgenden Schritte wurden in einer feuchten Kammer durchgeführt.

Da es sich bei der EnVision Methode um ein Peroxidase-System handelt, musste die endogene Peroxidase mit 3%igem H2O2 geblockt werden (5min. bei RT). Nach anschlies- sendem Waschen in PBS Puffer folgte eine Proteinblockierung (20min. bei RT) mit 10%igem Ziegenserum (da es sich um das EnVision Kit Ziege Anti-Maus handelte), um eine unspezifische Hintergrundfärbung auszuschließen. Es folgte die Inkubation mit dem primären Antikörper (Kapitel 8.6.2) und einem IgG1-Immunglobulin als Negativkontrolle für 30min. bei 37°. Nach dreimaligem Waschen mit PBS Puffer wurde das gebrauchsfertige Polymer- konjugat pipettiert und 30min. bei 37° inkubiert. Nach erneutem Waschen folgte die Substratumsetzung mit der Chromogen-Substrat-Lösung (AEC) für 8-10 Minuten bei RT. Nach gründlichem Auswaschen des Substrats mit Aqua dest. erfolgte die Gegenfärbung der

Zellkerne mit Mayers Hämatoxylin bei RT. Zum Bläuen der Zellkerne wurden die Schnitte bzw. die Chamberslides bis zu 30min. in Leitungswasser gestellt und anschließend mit einem wässrigen Eindeckmedium (Aquatex) eingedeckt, wobei bei den Chamberslides vor dem Eindecken die Kammern abgezogen werden mussten.

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 50-54)