A flagellinmolekula szerkezete

A flagellinmolekula polimerizációs tulajdonságait vizsgálva többen megfigyelték, hogy a filamentum kialakulása során a flagellinmolekula nagymértékű konformációs átrendeződésen megy keresztül. Ennek szerkezeti okát kutatva limitált proteolízissel és spektroszkópiai mérésekkel kimutatták, hogy a Salmonella typhimuriumból származó flagellin 494 aminosavból álló, 52 kDa molekulatömegű fehérje terminális régiói, 66 N-terminális és 44 C-N-terminális aminosavnyi rész, oldatban nem rendelkeznek kompakt, stabilis térszerkezettel [1]. Ezek a részek proteolitikus enzimekkel nagyon gyorsan leemészthetők, ami azt mutatja, hogy ezek a peptidláncok az emésztő enzimek számára szabadon hozzáférhetőek. A terminális régiók eltávolítása után egy viszonylag stabil, kb. 40 kDa molekulatömegű fragmentum (F40) marad vissza, amely igen lassan tovább emészthető egy 27 kDa-os fragmentummá (F27). Az F27 fragmentumról kimutatták, hogy az F40 fragmentumhoz képest 112 N-terminális és 28 C terminális aminosav hiányzik róla [6].

COOH NH2

(67) (179) (418) (446)

F27 F40 2.5. ábra

Az F40 és F27 fragmentumok elhelyezkedése a flagellinmolekulában [6]

Az F40 és F27 fragmentumok hődenaturációja reverzibilis, ami azt mutatja, hogy önálló térszerkezet kialakítására képes egységek (domének) alkotják őket. Kalorimetriás olvadásgörbékből megállapították, hogy a flagellin molekula magja 3 doménből épül fel. Az F27 fragmentumnak megfelelő régió két erős kölcsönhatásban álló doménből áll (G1, G2),

míg a harmadik (G3) domén nem folytonos, a 66-177 és a 423-450 szakaszok együttesen alkotják (2.5. ábra). Másodlagosszerkezet-jóslással és CD-spektrumok analízisével kimutatták, hogy az F27 fragmentum doménjei β-szerkezetűek, míg a G3 domén helikális és β-szerkezetet egyaránt tartalmaz. A G3 domén helikális szerkezete meghatározó szerepet játszik a filamentumok struktúrájának kialakításában [7].

A terminális régiókról ¹H-NMR-spektroszkópiás vizsgálatokkal kimutatták, hogy gyors, termikus fluktuációkat végeznek. Pásztázó mikrokalorimetriás eredmények szerint ezen régiók belső stabilitása elhanyagolható [4]. A terminális régiók azonban mégsem teljesen rendezetlenek, CD-spektroszkópiás mérésekkel igazolták, hogy nagy mennyiségű a-helikális szerkezeti elemeket tartalmaznak, amit a másodlagosszerkezet-jóslások is megerősítettek [7].

2.6. ábra

A flagellinmolekula szerkezeti egységei [7]

A flagellin molekula rendezetlen terminális régiói a molekula legkonzervatívabb részét képezik, ami a polimerizációban játszott fontos szerepükre utal. Ennek tisztázása nagy specifitású enzimekkel végzett irányított emésztéssel történt. Az oldatbeli rendezetlenségüknél fogva a terminális régiók enyhe emésztési körülmények között, nagy specifitású proteázokkal tervezett módon csonkíthatók. Az Endoproteináz Lys-C-nek (ELC) és az Endoproteináz Glu-C-nek (V8) egyaránt két hasítási helye található a rendezetlen terminális régiókban. Az ELC enzim az N terminálison hasít a 19. és az 58. helyen álló lizin után, így létrejöhet egy 49 (F49) és egy 46 kDa-os (F46) fragmentum. A V8 enzim első hasítóhelye a C-terminálison a 461. helyen álló, a második az N-terminálison a 29. helyen álló glutaminsav után található. V8 enzimmel történő limitált emésztés során egy 48 (F48) és egy 44 kDa-os (F44) fragmentum kapható. Tripszin segítségével a rendezetlen terminális

régiók teljesen eltávolíthatók, így a 40 kDa-os (F40) fragmentum, a flagellinmolekula kompakt stabil magja állítható elő. Az így kapott különböző méretű terminálisan csonkított fragmentumok FPLC ioncserélő kromatográfiás eljárással tisztíthatók [8].

A fragmentumok polimerizációs tulajdonságait vizsgálva azt tapasztalták, hogy többségük képes volt ammónium-szulfát jelenlétében filamentumokat létrehozni, ezek stabilitása azonban a hiányzó szegmensek méretétől függően kisebb volt, mint az eredeti flagellinből felépülő filamentumoké. A teljesen csonkított F40 fragmentum semmilyen körülmények között sem volt képes filamentumot alkotni. A csonkított fragmentumokból előállított filamentumok gyakorlatilag elvesztették polimorfikus képességüket, sem a pH, sem az ionerősség változtatásával nem sikerült polimorfikus átmeneteket előidézni a szerkezetükben. A fragmentumok polimerizációs viselkedése szempontjából hasonlónak bizonyult, hogy a C-terminális vagy az N-terminális régiók tartalmazzák a csonkítást. Ez arra utal, hogy a két régió együtt vesz részt a filamentum felépülésében. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a terminális régiók jelentős része nem szükséges a filamentáris szerkezet kialakításához, de meghatározó szerepük van a stabilizálásban, az önszerveződésben és a polimorfikus képességben [8].

A filamentumok röntgendiffrakciós és elektronmikroszkópos szerkezetanalízisével kimutták, miként építi fel a flagellinmolekula a filamentum szerkezetét. A filamentumok magját két koncentrikus gyűrű alakú struktúra alkotja. A különböző baktériumfajokból származó flagellinek aminosavsorrendjének összehasonlító elemzése azt mutatta, hogy a molekula kb. 180 N-terminális és kb. 100 C-terminális aminosavnyi része a legkonzerválódottabb. A csonkított fragmentumokból képzett filamentumok szerkezetvizsgálata azt mutatta, hogy a monomer állapotban rendezetlen terminális régiók egymással erős kölcsönhatásban elsősorban a belső gyűrű felépítésében vesznek részt. Ez a kölcsönhatás alapvető fontosságú a filamentumok polimorfikus tulajdonságai szempontjából.

Már néhány terminális aminosav hiánya is a filamentum belső magjának rendezetlenségét és a polimorfikus tulajdonság elvesztését okozza [9].

A külső gyűrűt elsősorban a G3 domént alkotó konzerválódott régiók építik fel, de a rendezetlen régió N-terminális 30-65 szegmense is fontos szerepet játszik. A filamentumok külső részét az F27-es fragmentum G1 és G2 doménjei építik fel, de ezek a régiók alig járulnak hozzá a filamentumok stabilizálásához [10].

2.7. ábra

A filamentum szerkezete elektronmikroszkópos és röntgendiffrakciós mérések alapján [11]

A mindkét terminálisán erősen csonkított 41 kDa-os (F41) fragmentum kristályosítása és röntgendiffrakciós vizsgálata révén meghatározták a filamentum szerkezetét [12]. A filamentumok külső gyűrűje tehát már atomi precizitással ismert, belső gyűrűjének felépüléséről azonban csak sejtések vannak. A feltételezések szerint a flagelláris filamentumok képződése során az axiálisan szomszédos egységek között az α-hélix képző N- és C-terminális régiók egymással kölcsönhatásba lépve, együtt képeznek helikális kötegeket. A helikális kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a filamentum szerkezetének kialakulását úgy, hogy a filamentum szabad végén lévő molekula N-terminális végéhez kapcsolódik a következő flagellinmolekula C-terminális része [13].