Über die Expression von Stammzell-relevanten Markern durch humane Periostzellen ist bisher wenig berichtet worden. Darum sollte in dieser Arbeit zum einen mittels FACS Analyse erstmals die Präsentation MSC-relevanter Oberflächenmarker durch Periostzellen analysiert werden und darüber hinaus mit genomweiten Affymetrix Mikroarrays das Genexpressionsprofil dieser Zellen aufgenommen werden.

4.6.1 FACS Analyse humaner Periostzellen

Um Informationen darüber zu erhalten, ob Zellkulturen humaner Periostzellen homogen vorliegen und ob die Zellen zudem MSC-relevante Oberflächenmarker präsentieren, wurden diese mittels FACS analysiert. Wie bereits die MSC, wurden die Periostzellen mit beschriebenen Markern hämatopoetischer und mesenchymaler Zellen in Einfach und in Mehrfachfärbung gefärbt und analysiert. Auch hier wurden die Zellen nach der Analyse mit PI inkubiert, um nekrotische Zellen zu markieren, und erneut gemessen (Kapitel 3.2)

Die Periost Zellkulturen dreier Donoren zeigten ein einheitliches Bild in der Darstellung SSC Height gegen FSC Height (Abbildung 4.31; nächste Seite). Hierbei war wie bei den MSC eine Hauptpopulation zu erkennen, die sich von einer zweiten Population kleiner Zellen abgrenzen ließ. Innerhalb der Hauptpopulation war eine Subpopulation (hell) zu erkennen, die durch das Fenster R1 eingegrenzt wurde. Erneut wurden nur die Zellen analysiert, die innerhalb des Fensters R1 lagen. Sie entsprachen der großen Mehrheit an Zellen und wiesen eine große Homogenität auf. Der Antikörper CD3 wurde wie bei den MSC als Isotypenkontrolle verwendet und wurde in keiner der Kulturen nachgewiesen (Abbildung 4.31). Die im Text aufgeführten Resultate beziehen sich auf die Abbildung 4.31 und auf die Tabelle 4.3 (übernächste Seite).

Wie im Kapitel 4.1.4 gezeigt, sind humane MSC überwiegend positiv für SH2, SH3, ALCAM, CD44, CD90 und negativ für CD14, CD34 und CD45. Auch die Periostzellen aller dreier Donoren, unabhängig davon ob in der Passage zwei, drei oder vier, waren für CD14 annähernd negativ (Tabelle 4.3, maximal 2% der Zellen waren CD14/SH2 doppeltpositiv). Mit einer Ausnahme hat auch keine der Kulturen im nennenswerten Umfang den Antikörper CD34 gebunden. Die Ausnahme war die Kultur der vierten Passage des Donors zwei, bei der 16% aller Zellen CD34/SH2+ doppeltpositiv waren. Wie bei den humanen MSC waren auch hier weniger als 0,5% aller Zellen einfach CD34+ gefärbt. Letzteres traf auch für CD45 zu (Tabelle 4.3, weniger als 0,5% aller Zellen im Sektor I). Im Gegensatz zu den MSC, waren aber relativ viele Periostzellen doppeltpositiv für CD45/SH2. Die Werte der in der Dot Plot Darstellung im Sektor II vorliegenden doppeltpositiven Zellen waren uneinheitlich und schwankten von 5% (Donor eins, P2) bis zu 92% (Donor drei, P2) aller analysierten Zellen.

Abbildung 4.31: FACS Analyse von Primärkulturen dreier Periost Spender (Passage 2).

Ein Trend, wie eine Zu- oder Abnahme der Präsentation über die Passagenzahl, war für CD45/SH2 aber nicht zu erkennen. Hinsichtlich der Präsentation von CD44 wiesen die Periostzellen ein recht einheitliches Erscheinungsbild auf. Anfangs lagen noch einige nicht CD44/SH2 doppeltgefärbte Zellen vor, in den Passagen drei und vier waren aber annähernd alle Zellen positiv für beide Antikörper. Die Präsentation von ALCAM ließ zwei Tendenzen erkennen. Zum einen zeigten die Donoren eins und zwei ein über alle Passagen sehr ähnliches, vom Donor drei abweichendes Verhalten auf. Sie waren in der Passage zwei zu etwa gleichen Teilen doppeltpositiv für ALCAM/SH2 (Sektor II) und einfachpositiv für SH2 (Sektor IV). Über den Kulturverlauf verschob sich dieses Gleichgewicht hin zu fast 100% ALCAM/SH2 doppelt gefärbten Zellen. Die Zellen des Donors drei waren hingegen über den ganzen Verlauf zu fast 100% doppeltpositiv. Qualitativ entsprach folglich auch die Präsentation von CD44 und die von ALCAM der in den MSC Kulturen beobachteten Expression dieser Marker. Alle humanen Periost Zellkulturen waren darüber hinaus in jeder Passage stark positiv für SH2, den Marker humaner MSC.

In jüngster Zeit wurde wie bei den MSC, auch die Expression des Markers SH3 analysiert. Bisher sind keine systematischen Untersuchungen über mehrere Passagen durchgeführt worden. Alle getesteten Kulturen entsprachen jedoch in etwa der Abbildung 4.32.

Es gilt festzuhalten, dass im Verlauf dieser Arbeit erstmals die Expression von verschie- denen MSC-relevanten Oberflächenmarkern von Periostzellen beschrieben wurde. Die vergleichende FACS Analyse von humanen MSC und von Periostzellen zeigte ein ähnliches Muster präsentierter Oberflächenmarker, wobei es einen wesentlichen Unterschied gab. Die hier analysierten Periostzellen waren in der CD45/SH2 Doppeltfärbung deutlich positiv, während die MSC annähernd negativ waren.

Sektor Passage 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 I P2 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 P3 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 P4 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 II P2 2 1 < 0,5 1 < 0,5 < 0,5 91 95 76 5 27 92 50 51 99 P3 < 0,5 0,5 2 0,6 2 < 0,5 97 97 99 8 25 87 79 75 99 P4 2 1 1 1,5 16 0,5 98 98 99 11 43 64 99 98 99 III P2 5 1 < 0,5 11 < 0,5 < 0,5 3 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 2 1 < 0,5 P3 0,8 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 1 1 < 0,5 P4 1 1 1 0,5 1 < 0,5 < 0,5 1 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 < 0,5 0,5 < 0,5 IV P2 93 98 99 88 99 99 6 4 24 94 72 8 48 49 1 P3 99 99 98 99 98 99 2 3 < 0,5 91 75 13 20 24 1 P4 97 98 98 98 83 99 1 1 < 0,5 89 56 35 < 0,5 1,5 0,5 Donor:

Donor: Donor: Donor: Donor:

CD14/SH2 CD34/SH2 CD44/SH2 CD45/SH2 ALCAM/SH2

Abbildung 4.32: FACS analytischer Nachweis der SH3 Expression humaner Periostzellen (P2).

Tabelle 4.3: FACS Analyse von Periost Zellkulturen der Passagen 2, 3 und 4 (3 Spender). Es liegen z.B. in den in der Kombination CD14/SH2 gefärbten Proben (Passage P3, Donor 1) weniger als 0,5% der Zellen im Sektor I (einfachpositiv für CD14), weniger als 0,5% der Zellen im Sektor II (doppeltpositiv für CD14/SH2), 0,8% der Zellen im Sektor III (doppeltnegativ für CD14/SH2) und etwa 99% der Periostzellen im Sektor IV (einfachpositiv für SH2).

4.6.2 Chip Analyse der Expression Stammzell-relevanter Marker

Neben der Durchführung der FACS Analyse zum Nachweis der Präsentation stammzell- relevanter Oberflächenmarker, wurde aus Periost Zellkulturen vierer Donoren (Passage zwei) die mRNA isoliert und diese, wie im Kapitel 3.6.3 skizziert, für die genomweite Mikroarray Analyse mittels Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 GeneChips prozessiert.

Es sei hier darauf hingewiesen, dass die durchgeführten Arrays nur einen ersten, aber sehr umfassenden Überblick, über das gesamte Genexpressionsprofil humaner Periostzellen des Mastoids geben sollten. Die Auswertung beruht nur auf den in der GCOS 1.2 Software integrierten Algorithmus zur Berechnung, ob ein spezielles Probe Set als Present, Absent oder Marginal detektiert wurde (Kapitel 3.6.3.1). Da solche Angaben letztlich auf Signalintensitäten beruhen, sind diese im Zweifelsfall mit Skepsis zu betrachten. Darüber hinaus ist bekannt, dass nicht alle z.B. mittels RT-PCR nachweisbaren Gene auch auf den Arrays detektiert werden. Dies wurde in dieser Arbeit bei dem Nachweis der Chemokin- rezeptor Expression humaner Periostzellen mittels RT-PCR offensichtlich. Im Gegensatz zur RT-PCR war fast keiner dieser Rezeptoren mit dem Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 GeneChip nachweisbar. Ein Fazit ist, dass die Array Ergebnisse in weiterführenden Studien noch mit ergänzenden Methoden verifiziert werden müssen.

4.6.2.1 Qualitätskontrolle der prozessierten Mikroarrays

Nach Beendigung der eigentlichen Array Durchführung wurde zunächst die Qualität der einzelnen Arrays bestimmt (Kapitel 3.6.3.1). Alle vier prozessierten Arrays zeigten visuell keine Besonderheiten. Auch das 3’/5’ Verhältnis des Haushaltsgens GAPDH, die Hybridi- sierung, die Skalierungsfaktoren der einzelnen Arrays sowie der Prozentsatz der als Present, Absent oder Marginal detektierten Signale zeigten keine Auffälligkeiten (Anhang, Kapitel 8.10.1). Alle Qualitätskontrollen fielen somit positiv aus.

4.6.2.2 Auswertung der Arrays humaner Periostzellen

Hier soll nur die Expression von ausgewählten Markergenen humaner embryonaler Stammzellen [Lee et al. 2005; Bhattacharya et al. 2004], hämatopoetischer Stammzellen [Wognum et al. 2003] und mesenchymaler Stammzellen durch Periostzellen angegeben werden [Otto et al. 2004; Barry & Murphy 2004; Pittenger et al. 1999]. Wie erwähnt, werden auf dem GeneChip einzelne Gene meist durch mehrere Sätze an Oligonukleotiden reprä- sentiert. Wenn nicht anders erwähnt, wurden in dieser Arbeit zur Auswahl der angegebenen Marker die sehr strikten Kriterien Present oder Absent bei allen vier Donoren und in allen Sätzen an Oligonukleotiden, die das Gen darstellen, verwendet. Im Anhang (Kapitel 8.10.2) werden die GenID, dass Gen Symbol sowie die Signalintensitäten und der der Call (Present, Absent, Marginal) aller genannten Marker aufgelistet. Insgesamt waren von den 54.675 Probe Sets des Arrays 14.715 Present für alle vier Periost Donoren.

Der Tabelle 4.4 ist zu entnehmen, dass in den Kulturen humaner Periostzellen keine Ex- pression von Markern undifferenzierter humaner embryonaler Stammzellen detektiert wurde.

Marker embryonaler Stammzellen, wie hTERT, der Transkriptionsfaktor Oct4/Pou5F1, Nanog, SOX1 und SOX2 wurden nicht detektiert. Der Marker SSEA-4/SIAT6 konnte in drei von vier Probe Sets nicht nachgewiesen werden und Rex1/ZFP42 nicht in zwei von drei Probe Sets. Die Signalintensitäten in den beiden Probe Sets, die auf eine mögliche Expres- sion von SSEA-4/SIAT6 bzw. Rex1/ZFP42 hindeuteten, waren sehr gering. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen ist über eine Expression von hTERT, Oct4/Pou5F1 und bestimmter anderer ES Marker durch Subpopulationen humaner MSC berichtet worden [Pochampally et al. 2004]. Dies deutet auf einen potentiell primitiveren Charakter humaner MSC hin.

Auch eine Expression von Markern hämatopoetischer Stammzellen, wie von CD11A/ LFA1α, CD11B/Mac1, CD14, CD34 und auch CD45 wurde nicht gemessen. Im Gegensatz dazu, wurde mittels FACS Analyse eine CD45/SH2 Doppelfärbung humaner Periostzellen detektiert (Kapitel 4.6.1). Der fehlende Nachweis im Array beruht potentiell auf den oben genannten, am Beispiel der Chemokinrezeptor Expression veranschaulichten, Limitierungen der Array Analytik.

Tabelle 4.4: Expression von Markern embryonaler, hämatopoetischer und mesen- chymaler Stammzellen durch Periostzellen (P2, n=4 Donoren, Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 Mikroarrays). Bedingungen: Present oder Absent bei allen 4 Donoren und in allen Probe Sets die für das Gen stehen. (#) Gene die nicht zu 100% diesen Bedingungen entsprachen (Text und Anhang, Kapitel 8.11).

(ABCG2: ATP-Binding Cassette, Subfamily G, Member 2, HLA-ABC: Major Histocompatibility Complex, Class I, ABC, hTERT: humane Telomerase Reverse Transcriptase, MAC: Macrophage Antigen Alpha Polypeptide, NANOG: Nanog Homebox, p75/NGFR: Nerve Growth Factor Receptor Associated Protein 1, POU5F1: POU Domain, Class 5 Transcription Factor 1, R: Rezeptor; SOX1/2: Sex Determing Region Y -Box1/2, SIAT6: ST3 Beta-Galactoside Alpha-2,3-Sialyltransferase 3, ZFP42: Zinc Finger Protein 42)

Markergene exprimiert von: Expression durch Periostzellen:

Pluripotenten embryonalen Stammzellen

Absent hTERT, NANOG, OCT4/POU5F1, REX1/ZFP42#, SSEA4/SIAT6#, SOX1, SOX2

Multipotenten hämatopoetischen

Stammzellen Absent ABCG2, CD11A(LFA-1α), CD11B(Mac-1), CD14, CD34, CD45, CD117/c-Kit Present

Extrazelluläre Matrixkomponenten Fibronectin (FN1), Laminin, Proteoglycane (Proteoglycan 4, Syndecan 2, Versican), Kollagene (Typ Iα1#,α2, IIIα1, Vα1,α2, VIIIα2, XIIα1#, XVα1#)

Sekretierte Proteine IL6, IL7#, IL8, LIF Oberflächenrezeptoren IL10Rβ, IL13Rα,β, PDGFRα, IFNγR1,2, TNFR1α

Oberflächenantigene ALCAM/CD166, HLA- ABC, p75/NGFR, SH2/endoglin#, SH3/CD73, CD44#, CD90

Integrine α4#, α5, β5 Ketten

Multipotenten mesenchymalen Stammzellen

Es sind bisher zahlreiche Marker humaner mesenchymaler Stammzellen des Knochen- marks beschrieben worden. Einige der immer wieder als wichtige Marker erwähnten sind in der Tabelle 1.1 (Kapitel 1.2) angegeben. Während der Arbeit zeigte sich, dass humane Periostzellen bezüglich der Expression dieser Marker viele Gemeinsamkeiten besitzen. Periostzellen exprimierten auf mRNA Ebene ein relativ großes Spektrum an (1) extra- zellulären Matrixkomponenten wie von Fibronectin, Laminin, Proteoglycanen und Kollagenen (die mit # indizierten Proteine wurden in der weitaus überwiegenden Zahl der Probe Sets, aber nicht in allen detektiert), (2) sekretierten Proteinen wie verschiedene Interleukine, (3) Oberflächenrezeptoren, (4) Integrine wie die Ketten α4, α5 und β5 und (5) Oberflächen- antigenen wie ALCAM, SH2, SH3, CD44 und CD90. Auffällig war, das SH2 nur in etwa 50% der Fälle auf dem Array detektiert wurde. Neben den genannten Gemeinsamkeiten mit humanen MSC, die bei weniger strikten Auswahlkriterien der Marker potentiell noch größer gewesen wären, zeigte sich, dass Periostzellen weniger Interleukine, Integrine, Wachstums- faktoren, Zytokine und deren Rezeptoren exprimierten. Die Expression von Mitgliedern der zuletzt genannten Faktoren und deren Rezeptoren wurde für humane MSC mit deren aktiven Rolle im Rahmen des Aufbaus und der Funktion des im Knochenmark inhärenten Stroma- gewebes in Verbindung gebracht [Majumdar et al. 1998; Dexter et al. 1977].

Als Fazit gilt es festzuhalten, dass nach dieser Arbeit das komplette Genexpressionsprofil von humanen Periostzellen des Mastoids vorliegt und dies zukünftig, neben den hier berich- teten Analysen, die Basis für weitere Studien sein wird. Insgesamt zeigten die humanen Periostzellen sowohl in der FACS Analyse als auch in der Mikroarray Analytik, zahlreiche Übereinstimmungen mit den humanen MSC des Knochenmarks, aber z.B. in der Expression von CD45 auch deutliche Unterschiede.

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 101-106)