Die Integrität des Genoms und des Epigenoms wird vielfach durch exogene und endogene Substanzen sowie durch hochfrequente elektromagnetische Strahlung verletzt, die Ursache von Zelltod, Erbkrankheiten und Krebs sein können. Kanzerogene Substanzen kann man in zwei Klassen, in genotoxische und nicht-genotoxische unterteilen. Erstere bewirken in einer Dosis-abhängigen Weise kovalente DNA-Schäden, die direkt zu Mutationen oder Chromosomenschäden führen; letztere verursachen die Kanzerogenese durch Veränderung der Expressionsmuster der Zelle, d.h. sie verändern das Epigenom. Diese Substanzen verursachen u.a. aberrante DNA-Methylierungsmuster, wie im vorangegangen Abschnitt beschrieben wurde.[247-248] Dementsprechend können diese Substanzen auch für aberrante DNA-Hydroxymethylierungsmuster verantwortlich sein. Eine besondere Stellung unter den kanzerogenen Substanzen nehmen hierbei die reaktiven Sauerstoffspezies ein (englisch:

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reactive oxygen species; ROS), die sowohl das Genom als auch das Epigenom oxidativ

schädigen können und deren Herkunft endogener wie exogener Natur ist. Potenzielle endogene Quellen sind die oxidative Phosphorylierung in Mitochondrien, der P450- Metabolismus, Peroxisomen und Entzündungsprozesse durch Immunabwehrzellen; exogene Quellen von ROS sind im allgemeinen Umweltgifte, also diverse Redox-Verbindungen, Schwermetalle und hochfrequente Strahlung.[247-249]

Oxidative DNA-Schäden sind von allen Nukleosiden (dA, dG, dT, dC und 5mdC) bekannt. Darunter ist 8-oxo-7,8-dihydroguanosin (8oxodG) am prominentesten, welches als ubiquitärer Marker für fast jede Art von zellulärem Stress dient.[249] Diese oxidativen Nukleobasen- Schäden können mutagen sein, aber auch indirekt z.B. die Dnmt1/Uhrf1-vermittelte Instandhaltung[100-102] von 5mdC blockieren und so zu einer Hypomethylierung des DNA- Abschnitts führen.[248] 5mdC kann ferner direkt durch Oxidationsreaktionen geschädigt werden, für die ROS[164, 250] sowie andere OH-Radikal-basierte Prozesse[251] oder foto- chemische Ein-Elektronen-Oxidationsreaktionen[163, 250, 252-254] verantwortlich sind. OH- Radikale werden z.B. durch Fenton-ähnliche Reaktionen (Fe(II)/Cu(II)) aus Wasserstoff- peroxid generiert, welches während des oxidativen Metabolismus in Mitochondrien gebildet wird (Schema 9A). OH-Radikale können mit 5mdC sowie mit dT auf zwei unterschiedliche Arten reagieren. Zum einen können sie Addukte mit den C5=C6-Doppelbindungen bilden und zum anderen die in Schema 9B gezeigte Abstraktion eines H-Atoms der Methylgruppe bewirken.[249, 256-257] Die Methylradikale können dann mit bimolekularem Sauerstoff unter

Bildung eines Peroxy-Radikals weiterreagieren und in anschließenden Zerfallsreaktionen die entsprechenden Alkohole und Aldehyde ausbilden. So wurde in Modellstudien 5hmdC und 5- Formyl-2′-desoxycytidin (5fdC) als oxidativer Schaden von 5mdC sowie 5hmdU und 5fdU als oxidativer Schaden von dT gefunden. Unter foto-oxidativen Bedingungen konnte ferner in

vitro die Bildung von 5-Carboxy-2′-desoxycytidin (5cadC) festgestellt werden, die jedoch

aufgrund einer geringen Effizienz wohl kaum biologisch signifikant ist.[253, 256] Im Gegensatz zu den Oxidationsschäden von dT steht der Nachweis für die analogen 5mdC-Schäden in zellulärer DNA unter natürlichen Bedingungen allerdings noch aus.[249]

In genomischer DNA wurden die Level des prominenten DNA-Oxidationsmarkers 8oxodG am besten untersucht. Diese sind mit durchschnittlich 14×106 pro dN stets höher im Vergleich zu anderen Oxidationsprodukten (z.B.: 8oxodG > 5fdU > 5hmdU).[258-260] Das europäische Standardkomitee für oxidative DNA-Schäden (ESCODD) einigte sich bzgl. 8oxodG auf einen Hintergrundwert von ~1×106 pro dN.[259] Höhere 8oxodG-Werte bzw.

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Unterschiede in den publizierten Messergebnissen von 8oxodG und anderen Oxidations- produkten sind dabei oft auf Effekte der Probenpräparation zurückzuführen, da vor allem beim Zellaufschluss endogene ROS freigesetzt werden, die zu artifiziell erhöhten Messwerten führen. Mittlerweile existieren eine Reihe von Protokollen, die diese Artefakte zu reduzieren versuchen, beispielweise durch Zusatz von Antioxidanzien beim Zellaufschluss[259, 261-263]

Schema 9 | Bildungswege epigenetisch relevanter DNA-Schäden durch reaktive Sauerstoff- spezies (engl.: reactive oxygen species, ROS). (A) ROS werden in Zellen durch exogene und

endogene Prozesse erzeugt. SOD = Superoxiddismutase. (B) ROS verursachen unter anderem die Bildung von Methylradikalen von dT und 5mdC und sind deshalb für die Entstehung der DNA Oxidationsschäden 5hmdU, 5fdU beziehungsweise 5hmdC und 5fdC verantwortlich.[255] Nota bene: dT

und seine Derivate (R = OH) liegen ausschließlich als (C=O)-N(H)-(C=O) Tautomer vor. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurde auf diese Darstellung verzichtet.

Genomisches 5hmdU und 5fdU kann nicht nur von der Oxidation von dT in genomischer DNA herrühren, sondern auch von der Oxidation von dT, dTMP und dTTP im Cytosol, bevor dieses per DNA-Replikation eingebaut wird.[248, 264] Obwohl 5hmdU und 5fdU in einer Watson-Crick-Basenpaarung mit dA nur geringfügig mutagen sind,[264-265] besitzen höhere Organismen eine signifikante Reparaturkapazität gegenüber diesen Oxidationsprodukten. Zellkulturen, deren Medien mit 5hmdU oder 5fdU versetzt wurden, starben in Folge der Inkorporation dieser Nukleoside in die DNA.[264, 266-270] Diese Sensitivität ging bei einer "5hmdU-Fütterung" vollständig verloren, wenn ein Knockout der Glykosylase Smug1 zuvor durchgeführt wurde.[266, 268] Die Toxizität von 5hmdU rührt in diesen Zellen also nur indirekt

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von dessen Einbau in DNA gegenüber dA her, aber direkt von anschließender Basen- Exzisionsreparatur. Warum könnte es für den Organismus wichtig sein, 5hmdU und 5fdU zu beseitigen, wenn doch diese im Kontext einer dA-Basenpaarung nicht zwingend mutagen sind? Aus der Sicht von Protein-DNA-Interaktionen scheint es offensichtlich zu sein, dass eine Hydroxygruppe bzw. Formylgruppe von 5hmdU bzw. 5fdU, die in der großen Furche der DNA exponiert ist, die physikochemischen Wechselwirkungen zu Proteinen stark beeinflusst. In diversen Studien konnte in diesem Zusammenhang ein negativer Einfluss von 5hmdU auf Bindungsaffinitäten von Transkriptionsfaktoren oder TATA-Box/TBP-Komplexen gezeigt werden.[271-276] In Analogie hierzu demonstrierten Valinluck et al., dass Oxidationsschäden von 5mCpG-Stellen wie 5hmdC und 8oxodG in vitro in der Lage waren die DNA-Protein- Interaktion zu dem Methyl-CpG-bindenden Protein MeCP2 zu stören. Wie bereits erwähnt ist MeCP2 u.a. für die Rekrutierung von Histon-Deacetylasen wichtig, um die Erhaltung von Heterochromatinstrukturen zu gewährleisten.[207] Des Weiteren kann die Anwesenheit von 5hmdC in Genkörpern die Transkription aktivieren, wie in Abschnitt 1.4.3 bereits beschrieben wurde.[202-204, 206] Zusammenfassend können also die Oxidationsschäden von dT und 5mdC den Chromatinstatus sowie die Expressionsmuster der Zelle aus dem Gleichgewicht bringen und die Krebsentstehung begünstigen.

Neben dieser klassischen Sicht, könnte sich die Zelle aber auch die Anwesenheit von Oxidationsschäden zu Nutze machen, denn das Leben in Abhängigkeit von Luftsauerstoff macht deren Vermeidung praktisch unmöglich.[261] In einigen kürzlich erschienen Arbeiten

wurde gezeigt, dass 8oxodG womöglich die Rezeptor-vermittelte Genaktivierung von Östrogen-, Myc- und Hypoxie-Genen reguliert.[277-280] Es wurde ein Modell entwickelt, in

dem die Bindung der entsprechenden Transkriptionsfaktoren die Rekrutierung der Histon- Demethylase LSD1 (Lysin-spezifische Demethylase) auslöst.[261, 281] Diese FAD-enthaltende Demethylase soll für die lokale Produktion von H2O2 während der Histondemethylierung

verantwortlich sein, welches naheliegende Guanine in der Promotorregion oxidiert und damit die BER auslöst. 8oxodG wird durch die 8-Oxoguanin-Glykosylase (OGG1) ausgeschnitten, die gleichzeitig mit einer Topoisomerase rekrutiert wird. Über den resultierenden Einzelstrangbruch kann schließlich die kondensierte DNA-Region relaxiert und die Transkription aktiviert werden.[261, 277, 280-281] Passend zu diesem Zusammenhang wurde berichtet, dass 8oxodG speziell in transkriptionell aktivem Chromatin etwa 5mal im Vergleich zu Heterochromatin angereichert ist (4.4 bzw. 0.9×10-6 pro dN) und damit als epigenetisch relevant betrachtet werden könnte.[261] Auch aus einer anderen Perspektive wurden mehrere DNA-Modifikationen, darunter 8oxodG, dU und abasische Stellen, die Substrate von BER

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sind, kürzlich als epigenetisch relevant eingestuft, da durch diese die Affinität des Transkriptionsfaktors CREB um mehr als zwei Größenordnungen ab- oder zunahm. CREB ist ein Vermittler, durch den mehr als 25% des Transkriptoms von Säugetieren reguliert wird. Durch die Anwesenheit von BER-Substraten bestünde für die Säugetierzelle die Möglichkeit den Grad der Transkriptionsaktivierung entsprechend fein zu justieren.[282] Da jedoch noch sehr wenig über die möglichen zugrundeliegenden Mechanismen bekannt ist, müssen weitere Forschungen in diese Richtung angestrebt werden, bevor eine epigenetische Relevanz dieser Modifikationen neben der klassischen, Krebs-verursachenden Eigenschaft etabliert ist.

Im Dokument Synthese und Analyse von natürlichen DNA-Modifikationen zur Aufklärung des epigenetischen DNA-Metabolismus (Seite 46-50)