5.1 Humane MSC des Knochenmarks

5.1.3 Chemokin induzierte Migration humaner MSC

Mittels qualitativer und semiquantitativer RT-PCR sowie spezifischer Antikörper wurde das vollständige Chemokinrezeptor Expressionsprofil humaner MSC bestimmt. Darüber hinaus ist ein Chemotaxis Assay etabliert worden, mit dem die dosisabhängige chemotaktische Wir- kung verschiedener Chemokine auf humane MSC untersucht werden konnte. Die Unter- suchungen sollten primär den Proof of Principle für die Eignung von Chemokinen als Rekru- tierungsfaktoren im Kontext des in situ Tissue Engineering erbringen. Darüber hinaus sollte die Dosis-Effekt-Kurve ausgewählter Chemokine aufgenommen werden, um potentielle Kandidaten für in vivo Studien zu selektieren.

Über das in situ Tissue Engineering zur Regeneration muskuloskelettaler Defekte ist vorne berichtet worden (Kapitel 1.6). Für die zukünftige Regeneration von Knorpel mittels solcher Ansätze stellt sich die Situation stark vereinfacht wie folgt dar (Abbildung 5.1):

Wenn ein traumatisch oder durch Erkrankungen bedingter Knorpeldefekt eine Verbindung zum darunter befindlichen durchbluteten subchondralen Knochen aufweist, können MSC in den Defekt bzw. in ein den Defekt ausfüllendes Implantat einwandern und dort zum Ersatz- knorpel differenzieren [Shapiro et al. 1993]. Das Implantat enthält chemotaktische Faktoren

Abbildung 5.1: Schematische Darstellung des in situ Knorpel Tissue Engineering.

bzw. setzt diese frei (Abbildung 5.1; oberer Pfeil), welche die MSC aus dem Knochenmark rekrutieren (Abbildung 5.1; unterer Pfeil). Faktoren der TGFβ Superfamilie sowie weitere Chondroinduktoren wie Hyaluronsäure oder Synovialflüssigkeit, die eine Knorpelbildung initiieren und steuern, werden ebenfalls in das Biomaterials inkorporiert. Besteht zwischen dem Knorpel und dem Knochenmark keine Verbindung, so wird diese mittels subchondraler Anbohrung (Drilling) oder Mikrofrakturierung geschaffen [Steadman et al. 2001].

Die qualitative RT-PCR und die semiquantitative real-time RT-PCR zeigten, dass humane MSC ein weites Spektrum an Chemokinrezeptoren aller vier Chemokin Subfamilien exprimie- ren. Die Anwesenheit verschiedener Rezeptoren wurde in aktuellen Studien bestätigt [Sordi et al. 2005; Luttichaux et al. 2005; Honczarenko et al. 2005]. In dieser Arbeit konnte über die zitierten Studien hinausgehend, eine Expression von CCR2, CCR8, XCR und von CXCR1-3 nachgewiesen werden. Die Immunhistochemie bestätigte die Präsentation von CCR2, CCR8 und CXCR1-3. Insgesamt gilt es festzuhalten, dass die mRNA Expression aller Rezeptoren wenig ausgeprägt war (10-4% bis 10-1% der Expression von GAPDH). Beim Vergleich der Daten mit Literaturdaten ist auffällig, dass je nach Arbeitsgruppe mehr oder weniger vonein- ander abweichende Chemokinrezeptor Expressionsprofile beschrieben wurden. Dies lässt sich potentiell durch unterschiedliche Protokolle zur Isolierung humaner MSC erklären, aber auch mit Variationen zwischen den einzelnen Donoren sowie deren aktuellen Zustand. So lassen sich die Chemokine und ihre Rezeptoren in eine konstitutiv sezernierte Gruppe (CCR4, CCR7, CCR9, CXCR4-5), eine durch Faktoren wie IL1 und TNF induzierbare Grup- pe (CCR1-3, CCR5-6, CXCR1-3) und eine überlappende Gruppe (CC8, CCR10, CXCR6) unterteilen [Murphy et al. 2000]. Je nach Zustand des Donors wird sich die Präsentation ein- zelner Rezeptoren und deren Ansprechbarkeit durch ihre Liganden ändern.

Hinsichtlich der in situ Knorpeltherapie ist von Interesse, dass auch humane Chondrozyten verschiedene Chemokine sekretieren, die potentiell humane MSC des Knochenmarks in vivo rekrutieren können [De Ceuninck et al. 2004]. So zeigten Antikörper Mikroarrays, dass so- wohl Chondrozyten von Normalspendern als auch von Patienten mit Osteoarthrose mehr als 20 Chemokine, darunter CCL2 (den CCR2 Liganden), CCL1 (den CCR8 Liganden), CXCL8 (einen CXCR1 und CXCR2 Liganden) und CX3C (den CX3CR Liganden) sekretieren. Über die Rolle von Chemokinen und deren Rezeptoren während der Differenzierung von Knorpel und während der Embryonalentwicklung ist wenig bekannt. CXCL1 wird während der muri- nen Embryonalentwicklung im kondensierenden Mesenchym exprimiert [Luan et al. 2001]. Das Muster der CXCL1 Expression ist mit dem der CXCR2 Expression verbunden, was eine Bedeutung von CXCL1/CXCR2 Interaktionen während der Skelettentwicklung nahe legt.

Vor der Durchführung der hier durchgeführten Analysen zur Chemokinrezeptor Expression wurde davon ausgegangen, dass humane MSC ein eng umgrenztes Spektrum an Chemo- kinrezeptoren exprimieren. Über dieses Spektrum sollten wenige Chemokine selektiert werden, deren migratorische Wirkung dann im Chemotaxis Assay getestet werden sollte. Diese Strategie erwies sich im Laufe der Arbeit aufgrund des weiten Spektrums präsentierer Rezeptoren als nicht durchführbar. CXCL8, CXCL12 und CCL2 wurden dann deshalb aus- gewählt, weil deren migratorische Wirkung auf Stromazellen beschrieben war [Wang et al. 2002], CXCL8 und CCL2 während akuter Erkrankungen verstärkt von den betroffenem Orga- nen/Geweben sekretiert werden (Kapitel 1.5) und eine Wirkung von CXCL8 und CCL2 auf humane MSC sowie die Expression derer Rezeptoren durch MSC noch nicht gezeigt wurde.

CXCL8/IL8 und CXCL12/SDF1α zeigten in dieser Arbeit einen dosisabhängigen chemotak- tischen Effekt. Die Wichtigkeit von CXCL12 und seinem Rezeptor CXCR4 ist offensichtlich. So resultiert in der Maus ein Knock-out des CXCL12 Gens oder des CXCR4 Gens im identi- schen Phänotyp, nämlich in ausgeprägten Defekten des Knochenmarks. Die Mäuse sterben bereits während der frühen Entwicklung [Zou et al. 1998]. Es wird vermutet, dass der Fehler im Knochenmark darauf beruht, dass während der Embryonalentwicklung hämatopoetische Progenitorzellen nicht von der fötalen Leber zum Knochenmark migrieren können; CXCL12 und CXCR4 also an der Stammzellmigration beteiligt sind. Weitere Hinweise auf die Bedeutung von SDF1α wurden bereits genannt (Kapitel 1.5). Die Zahl migrierter Zellen war, wie im Kapitel 4.3.2.2 erwähnt, gering (<1%). In der aktuellen Literatur wird teils über eine Wanderung von mehr Zellen berichtet, wobei dort zum Teil nicht mit serumfreien Medien gearbeitet wurde. Insgesamt bewegen sich die Zahlen aber im geringen Bereich [Wynn et al. 2004]. Manche Studien resultierten in einem glockenförmigen Verlauf der Dosis-Effekt-Kurve [Wynn et al. 2004], andere zeigten keinen solchen Verlauf [Sordi et al. 2005]. Silberstein konnte keinen migratorischen Effekt von CXCL12 nachweisen [Silberstein et al. 2005].

Allgemein werden zwei Mechanismen der Chemoattraktion unterschieden, nach denen Zellen im Organismus rekrutiert werden [Kim & Broxmeyer 1998]. Der Begriff Chemotaxis bezeichnet die zielgerichtete Migration von Zellen als Antwort auf einen Konzentrations- gradienten eines chemotakisch aktiven Moleküls. Der Begriff Chemokinese bezeichnet eine ungerichtete Bewegung einer Zelle als Antwort auf einen chemischen Reiz, ein Gradient muss nicht vorliegen. Die Bewegung wird dabei an die jeweilige Konzentration eines Lockstoffes gebunden. Die Gruppe um Honczarenko konnte für alle in vitro getesteten Chemokine eine Chemoattraktion aufgrund einer Chemotaxis messen, eine Chemokinese war nicht nachweisbar [Honczarenko et al. 2005]. Dies entsprach von Fiedler gemachten Beobachtungen zur BMP2 und BMP4 stimulierten in vitro Chemoattraktion [Fiedler et al. 2002]. Entsprechende Untersuchungen wurden in dieser Arbeit nicht durchgeführt.

In einer kürzlich veröffentlichten Publikation wurde angedeutet, dass humane MSC mRNAs für die CXCL8/IL8 Rezeptoren CXCR1 und CXCR2 exprimieren [Lisignoli et al. 2006], was den Ergebnissen dieser Arbeit entsprechen würde. Eine Präsentation beider Rezeptoren ist bisher vor allem mit akuten Entzündungsprozessen und der angeborenen Immunität in Verbindung gebracht worden [Murphy et al. 2000]. Das induzierbare Chemokin CXCL8 wird wie auch CCL2 in der Ratte nach erfolgtem Schlaganfall verstärkt sekretiert [Kim 1996]. CXCL8 konnte in der vorliegenden Arbeit im Chemotaxis Assay eine Wanderung von huma- nen MSC auslösen. Dies deutet auf eine potentielle Beteiligung von CXCL8 an der in vivo Rekrutierung von MSC hin. Ein migratorischer Effekt von CXCL8 war bisher vor allem für Neutrophile [Spanaus et al. 1997] aber auch für Stromazellen des Knochenmarks beschrie- ben worden [Wang et al. 2002]. Im Vergleich zu den humanen MSC, wanderten in den Stromazell Assays mehr Zellen (bis etwa 10%). In Chemotaxis Assays konnte anhand verschiedener Zelltypen gezeigt werden, dass der Rezeptor CXCR2 unselektiv für CCL8 ist, wohingegen CXCR1 selektiv für CXCL8 ist [Lötscher et al. 1994; Lee et al. 1992].

Aktivierte T-Zellen, Monozyten und Basophile repräsentieren wichtige Ziele für CCL2/ MCP1 [Lahrtz et al. 1998]. Obwohl der Rezeptor für CCL2, nämlich CCR2, bei den MSC auf der mRNA Ebene und zumindest bei einem von drei Donoren auch auf der Proteinebene nachgewiesen wurde, konnte dieser Faktor im Chemotaxis Assay reproduzierbar nicht mehr

Zellen rekrutieren, als in der Kontrolle gewandert sind. In der Ratte hingegen konnte in vivo und bei humanen Stromazellen in vitro ein Effekt von CCL2 auf die Migration nachgewiesen werden (Kapitel 1.5) [Wang et al. 2002]. Auch hier war also ein Unterschied zwischen huma- nen Stromazellen und den hier verwendeten mesenchymalen Stammzellen zu beobachten.

Aus den genannten Resultaten ergibt sich insgesamt, dass der hier etablierte 96-Well Chemotaxis Assay dafür geeignet ist, als Werkzeug für die Untersuchung von potentiell auf humane MSC chemotaktisch wirkende Faktoren zu dienen. Hierbei ist ein hoher Test- durchsatz möglich. Der Proof of Principle für die Anwendung von Chemokinen als Rekrutie- rungsfaktoren im Rahmen des in situ Tissue Engineering konnte erbracht werden. Darüber hinaus kann zusammengefasst werden, dass Chemokine aller Voraussicht nach in vivo im Rahmen akuter Erkrankungen u.a. an der Rekrutierung humaner MSC zu den entsprechen- den Organen/Geweben beteiligt sind. Die Forschung hierzu steht noch relativ am Anfang. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen auch nahe, mit dem Assay weitere potentielle chemotak- tische Faktoren bzw. Kombinationen dieser zu testen, um weitere Kandidaten für präklinische Tests zu selektieren. Hierbei muss berücksichtigt werden, an welchen physiologischen Prozessen die potentiellen Kandidaten noch beteiligt sind, die einer thera- peutischen Anwendung entgegenstehen.

In letzter Zeit wurde berichtet, dass die Homing bzw. Migratationsaktivität von MSC während der Expansion abnimmt. So zeigten Rombouts & Ploemacher, dass sich 60% der murinen MSC, die direkt nach der Isolation intravenös injiziert wurden, nach 24 Stunden im Knochenmark der Maus nachweisen lassen. Vorher für zwei Tage kultivierte MSC ließen sich nicht im Knochenmark nachweisen [Rombouts & Ploemacher 2003]. In einer anderen Arbeit wurden humane MSC mehr als zehn Passagen kultiviert [Honczarenko et al. 2005]. Hier zeigte sich ebenfalls eine Abnahme des Homing Potentials, was im Einklang mit einer Abnahme der Präsentation von Chemokinrezeptoren und einer verminderten in vitro Migration stand. Dies unterstreicht die Wichtigkeit von in situ Therapien, bei denen keine MSC expandiert werden müssen.

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 132-135)