5.1 Humane MSC des Knochenmarks

5.1.1 Charakterisierung humaner MSC

Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wird, können humane mesenchymale Stammzellen reproduzierbar aus Aspiraten des Knochenmarks adulter Spender isoliert und in vitro extensiv expandiert werden.

Obwohl die hier durchgeführten Untersuchungen letztendlich zur Etablierung der Basis für die Entwicklung von klinischen in situ Tissue Engineering Therapien dienten, bei denen eine Isolierung der MSC entfällt, gilt es festzuhalten, dass initial diese Zellen zur Durchführung von Studien isoliert und ex vivo charakterisiert werden müssen. Darüber hinaus sind die Ergebnisse generell auch für Therapien von Interesse, die auf einer Injektion von Stamm- zellen oder auf der Transplantation von Konstrukten aus MSC und Biomaterialien beruhen. Hinsichtlich der Verwendung unterschiedlicher Gewebe zur Isolierung von MSC gilt es weiterhin festzuhalten, dass humane Knochenmarkaspirate gegenüber z.B. Knochenbiop- sien [Nöth et al. 2002] oder Aspiraten des Fettgewebes einen Vorteil bieten [Zuk et al. 2001], denn ein wesentlicher Aspekt der Entnahme von Spendermaterial ist die damit einher- gehende Belastung des Spenders durch den chirurgischen Eingriff. Hier ist nach Abwägung der Begleitparameter die Methode zu wählen, welche mit minimalen Komplikationen verbunden ist und eine maximale Zellausbeute multipotenter MSC gewährleisten kann. Die Entnahme von Knochenmarkaspiraten stellt ein klinisch etabliertes Standardverfahren dar, welches weltweit im Zuge der Knochenmarktransplantation zum Einsatz kommt. Daher stel- len Knochenmarkaspirate des Sternums oder des Beckenkamms hinsichtlich ihrer zellulären Zusammensetzung unter geeigneten Bedingungen eine zu bevorzugende Quelle zur Gewin- nung von humanen MSC dar.

Es war mit dem vorgestellten Protokoll routinemäßig möglich, aus 2-5ml Knochenmark- aspiraten Kulturen mit spindelförmig fibroblastoiden MSC anzulegen. Die dabei zunächst individuell spindelförmig vorliegenden Zellen entsprechen potentiell den in der Literatur beschriebenen Colony Forming Units (CFU) [Friedenstein et al. 1976] und sind der Ursprung für die Namensgebung Colony Forming Units Fibroblasts (CFU-Fs), welche teilweise alter- nativ zur Bezeichnung MSC verwendet wird [Prockop 1997]. Die Wachstumskinetik humaner MSC des Knochenmarks ist in der Literatur bereits beschrieben worden [Bruder al. 1997b; Haynesworth et al. 1992b]. In der vorliegenden Arbeit entwickelten sich pro 1x106 ausgesäte Zellen etwa 1-3 Kolonien humaner MSC aus, die dann expandiert wurden. Obgleich wie für alle Primärzellkulturen typisch variierend, wuchsen dabei aus ursprünglich etwa 2x105 Zellen der Fraktion geringer Dichte des Percoll Dichtegradienten am Ende der Passage null etwa 1,5x104 humaneMSC aus. Durch Verwendung von 3D Kulturverfahren im Bioreaktor könnte das vorhandene proliferative Potential der MSC noch weiter genutzt und maximiert werden. In diesem Zusammenhang seien auch echte [Baksh et al. 2003] oder auf Mikroträger basierende Suspensionskulturen genannt [Wu et al. 2003].

Die isolierten Zellen konnten zum Nachweis ihres multipotenten Charakters reproduzierbar in Zellen der adipogenen, chondrogenen und osteogenen Entwicklungslinie gelenkt werden. Hierzu wurden Standard Assays verwendet [Pittenger et al. 1999; Johnstone et al. 1998; Jaiswal et al. 1997]. Der Nachweis wurde mittels histochemischer und immunhistochemi- scher Färbungen sowie mittels RT-PCR geführt.

Es wurde in keiner humanen MSC Kultur ein spontanes Auftreten der chondrogenen Entwicklungslinie beobachtet. Jedoch kam es in sehr seltenen Fällen zur spontan induzierten adipogenen (erkennbar durch eine Bildung von Fetttröpfchen) und osteogenen (erkennbar durch eine Bildung von Nodules) Entwicklung. Dies ist als Ausdruck des multipotenten Potentials und der Plastizität mesenchymaler Stammzellen zu deuten (Kapitel 1.1).

Die durchgeführten FACS Analysen unter Verwendung von Einfach- und von Mehrfach- färbungen zeigten eine Präsentation der für humane MSC beschriebenen Oberflächen- marker ALCAM, SH2, SH3, CD44 und CD90 sowie eine nicht vorhandene bis geringe Prä- sentation der hämatopoetischen Marker CD3, CD14, CD34 und CD45. Dies belegt eine deutliche Dominanz von Zellen der mesenchymalen Entwicklungslinie in den analysierten Passagen zwei, drei und vier und steht im Einklang mit Berichten anderer Arbeitsgruppen [Barry & Murphy 2004; Pittenger et al. 1999]. Das Antikörperspektrum zeigt aber auch, dass MSC kein spezifisches Antigenprofil besitzen, sondern u.a. epitheliale sowie endotheliale Marker präsentieren [Pittenger et al. 1999]. Es gilt darüber hinaus zu erwähnen, dass von klonalen MSC abgeleitete Kulturen nicht homogen sind, sondern aus mindestens drei morphologisch unterscheidbaren Zelltypen zusammengesetzt sind: (1) zum überwiegenden Teil aus großen unförmigen Zellen geringer proliferativer Aktivität mit vermindertem Differen- zierungspotential (mature MSC), (2) aus spindelförmigen proliferierenden Zellen und (3) aus kleinen runden sich selbst erneuernden Zellen (rapidly self renewing cells, RS), die wie die spindelförmigen ein ausgeprägtes Differenzierungspotential aufweisen [Colter et al. 2001]. Neben dem unterschiedlichen Proliferations- und Differenzierungspotential weisen all diese Zellen auch ein abweichendes Profil an präsentierten Oberflächenmarkern auf. So sind alle negativ für die oben genannten hämatopoetischen Marker. Die mature MSC sind schwach positiv für den hämatopoetischen Marker c-Kit (CD117), die RS Zellen hingegen nicht [Colter et al. 2001]. Die letzte Aussage trifft auch für den Marker Stro1 zu [DiGirolamo et al. 1999]. CD90 ist für die mature MSC positiv, hingegen bei RS-Zellen kaum nachweisbar.

Aus den FACS Analysen wird deutlich, dass bis zur Etablierung eines verwendungsfähigen Klonierungsverfahrens für humane MSC, basierend auf einer Zellsortierung über einen MSC Marker, wie er mit CD133 oder CD34 für humane hämatopoetische Stammzellen verfügbar ist [Kobari et al. 2001], die Isolate einen variierenden Grad an Inhomogenität aufweisen. Sie stellen potentiell eine Mischpopulation von mesenchymalen Zellen unterschiedlicher Proliferations- und Differenzierungskapazität dar. Dies sollte hinsichtlich einer klinischen Therapie mit in vitro expandierten MSC bedacht werden und evt. die verwendeten MSC bereits ex vivo mit exogenen Stimuli oder gentechnischen Methoden in die gewünschte Entwicklungsrichtung gelenkt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das etablierte Zellkulturverfahren geeignet ist, um die Einflussnahme unterschiedlicher exogener Faktoren, wie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren und von Chemokinen, auf humane mesenchymale Stammzellen zu untersuchen.

Im Dokument Differenzierungs- und Migrationspotential mesenchymaler Stamm- und Progenitorzellen für das in situ Tissue Engineering (Seite 128-130)