3.1. A vizsgálatokban részt vevő terhes és nem terhes nők
A vizsgálatok résztvevői a Semmelweis Egyetem I. Számú Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, valamint a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömb Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályának páciensei közül kerültek ki. Mindegyik résztvevő a kaukázusi rasszhoz tartozott és a Közép-Magyarország régióban lakott. Kizárási kritérium volt a többes terhesség, a diabetes mellitus, az autoimmun megbetegedések, angiopátiák, vesebetegségek, az anyai vagy magzati fertőzés és a magzati fejlődési rendellenességek. A vizsgálatok éhgyomorra történtek, a terhesek közül egyiknél sem volt megindult szülés vagy idő előtti burokrepedés észlelhető. Az egészséges nem terhes nők egyike sem részesült hormonális fogamzásgátló kezelésben, és a vizsgálatok a menstruációs ciklusuk korai follikuláris fázisában (a 3. és 5. ciklusnap között) történtek.
A terhességi hipertóniák klasszifikációját a National High Blood Pressure Education Program (NHBPEP) Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy és az American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) 2002-es definíciójának megfelelően végeztük (148, 149). A praeeclampsia kritériumának a korábban normotóniás terheseknél a 20. terhességi hét után jelentkező magas vérnyomást (legalább hat óra különbséggel ≥2 alkalommal ≥140 Hgmm szisztolés vagy ≥90 Hgmm diasztolés vérnyomás) és fehérjevizelést (≥0,3 g/24h vagy ≥1 + a vizelet gyorsteszten húgyúti fertőzés nélkül) tekintettük. Minden praeeclampsiás résztvevő normotóniássá vált a szülést követő 12. hétig. A praeeclampsiát súlyosnak tekintettük, ha bármelyik a következő kritériumok közül teljesült: ≥160 Hgmm szisztolés vagy ≥110 Hgmm diasztolés vérnyomás, proteinuria ≥5 g/24h (vagy ≥3 + a vizelet gyorsteszten), trombocitopenia, emelkedett májenzim értékek, oliguria/anuria, szubjektív tünetek (tartós fejfájás, látászavar, epigastrialis vagy jobb bordaív alatti fájdalom) vagy tüdőödéma. A HELLP-szindróma diagnózisa a jellemző laboratóriumi eltéréseken alapult (trombocitaszám <150 G/l, szérum GOT és GPT aktivitás >70 E/l, LDH aktivitás >600 E/l).
Korai kezdetű praeeclampsiáról akkor beszéltünk, ha annak tünetei a betöltött 34. terhességi hét előtt léptek fel. Gesztációs hipertóniát akkor diagnosztizáltunk, ha a korábban normotóniás terheseknél a 20. terhességi hét után magas vérnyomás jelentkezett fehérjevizelés nélkül. Krónikus hipertóniát akkor állapítottunk meg, ha a magas vérnyomás a terhesség előtt is fennállt, vagy ha az a 20. terhességi hét előtt jelentkezett, illetve ha szülés után 12 héttel is emelkedett vérnyomás értékeket mértünk. Rárakódásos praeeclampsiáról akkor beszéltünk, ha
a krónikus hipertónia talaján a 20. terhességi hét után fehérjevizelés jelent meg. Az intrauterin növekedési retardáció (IUGR) diagnózisát akkor állítottuk fel, ha a magyarországi születési súlypercentilis táblázat alapján az újszülött születési súlya az adott terhességi korra és nemre vonatkozó 10 percentilis értéket nem érte el (150).
Vizsgálatainkat a Semmelweis Egyetem Regionális, Intézményi Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága jóváhagyta (TUKEB 177/1999, 52/2008, 188/2008, 184/2013), és előzetes tájékoztatást követően minden résztvevő írásban hozzájárulását adta a vizsgálatok elvégzéséhez. Tudományos vizsgálatainkat a Helsinki Deklarációban foglaltaknak megfelelően végeztük.
Az egyes vizsgálatokban részt vevő terhes és nem terhes nők számát és klinikai adatait az Eredmények című fejezetben ismertetem.
3.2. A biológiai minták levétele, előkészítése és tárolása
A vérmintákat alkari vénapunkcióval vettük le natív, valamint EDTA és nátrium-citrát antikoagulánsokat tartalmazó kémcsövekbe (BD Vacutainer, BD Biosciences, San Jose, Kalifornia, USA). Ezt követően a mintákat szobahőmérsékleten 10 percig 3000 g-vel centrifugáltuk. A szérumot és plazmát -80 °C-on, míg az EDTA-val alvadásgátolt vérmintákból származó buffy coat-ot -20 °C-on tároltuk a vizsgálatok elvégzéséig.
A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) lítium-heparinos kémcsőbe (BD Vacutainer) levett friss vérből sűrűség-grádiens centrifugálással (Ficoll Paque, Amersham Biosciences AB, Uppsala, Svédország; 27 perc, 400 g, 22 °C) izoláltuk. A sejteket foszfáttal pufferelt fiziológiás sóoldattal kétszer átmostuk, majd RPMI 1640 médiumban (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) szuszpendáltuk. Ha a vizsgálatokra később került sor, a sejteket 10% dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmazó magzati borjú savóban -80 °C-on tároltuk azok elvégzéséig.
A lepényi mintákat közvetlenül császármetszést követően vettük a köldökzsinór eredése és a lepény széli része közötti területről, elkerülve az infarctusos és meszes régiókat.
A lepényi minta egy darabját fixálás nélkül műanyag csőbe helyeztük, és -80 °C-on tároltuk a vizsgálatok elvégzéséig. A minta másik részét 10%-os formalin oldattal 4 napig fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk.
3.3. A szérum sFlt-1 és PlGF koncentráció meghatározása
A szérum össz sFlt-1 és biológiailag aktív PlGF szinteket elektrokemilumineszcens immunoassay (Elecsys, Roche, Mannheim, Németország, Cat. No. 05109523 és 05144671) útján határoztuk meg Cobas e 411-es analizátoron (Roche, Mannheim, Németország).
A szérum sFlt-1 koncentráció meghatározásának lépései:
A módszer a szendvics-elven alapul. A vizsgálat teljes időtartama: 18 perc.
• 1. inkubáció: A mintában (20 µl) az sFlt-1-specifikus monoklonális biotinilált antitest és a ruténium komplexszel jelölt sFlt-1-specifikus monoklonális antitest reakciója során immunkomplex jön létre.
• 2. inkubáció: A sztreptavidinnel fedett mikroszemcsék hozzáadása után a biotin és a sztreptavidin között kialakuló kölcsönhatás következtében a komplex a szilárd fázishoz kötődik.
• A berendezés a reakcióelegyet a mérőküvettába szívja, ahol a (mágnesezhető) mikroszemcséket az elektróda a felszínén mágneses úton befogja. A kötetlen anyagok ezután a ProCell-lel együtt távoznak a rendszerből. Az elektródára kapcsolt feszültség kemilumineszcens fénykibocsátást indukál, amit egy fotosokszorozó mér.
• Az eredményeket a készülék a kalibrációs görbe alapján határozza meg, amelyet készülék-specifikusan, 2-pontos kalibrációval és a reagens-vonalkódból leolvasott mestergörbe felhasználásával generál.
A szérum PlGF koncentráció meghatározásának lépései:
Alapja a szendvics-elv. A vizsgálat teljes időtartama: 18 perc.
• 1. inkubáció: A minta (50 µl), a PlGF-specifikus biotinilált monoklonális antitest és a ruténium komplexszel jelölt PlGF-specifikus monoklonális antitest reakciója során immunkomplex jön létre.
A további lépések megegyeznek a szérum sFlt-1 meghatározásánál leírtakkal.
3.4. A vérplazma PlGF koncentrációjának meghatározása „betegágy melletti” gyorsteszt segítségével
Az EDTA-val antikoagulált plazmaminták szabad PlGF szintjének meghatározása az Alere Triage PlGF gyorsteszttel (Alere, Ballybrit, Galway, Írország) történt a gyártó utasításainak megfelelően. A vizsgálat a plazma PlGF szint fluoreszcens anyaggal jelölt monoklonális antitesttel történő meghatározásán alapul és egyszer használatos teszt kazettával
történik. A mérés menete: 250 µl szobahőmérsékletű vérplazmát pipettázunk a kazetta mintaablakába, majd behelyezzük a mérőkészülékbe (Alere Triage MeterPro), és a kijelzőn 15 percen belül leolvassuk a pg/ml-ben megadott értéket. A kazetta beépített pozitív és negatív kontrollt is tartalmaz, mely biztosítja a kapott kvantitatív PlGF eredmények hitelességét. Az eszköz mérési tartománya 12–3000 pg/ml. A 12 pg/ml alatti értékek a vizsgáló számára a kijelzőn a „<12 pg/ml” jelzéssel jelennek meg. A teszt a gyártó javaslata alapján a betöltött 35. terhességi hét előtt alkalmazható.
3.5. A vérplazma ADAMTS13 aktivitásának meghatározása
Az ADAMTS13 aktivitás meghatározása a FRETS-VWF73 fluoreszcens szubsztrát (Peptides International, Louisville, Kentucky, USA) hasításából eredő fluoreszcencia kinetikus mérésével történt (151). A citrátos plazmamintákból reakció pufferrel (5 mM Bis-Tris, 25 mM CaCl2, 0,005% Tween 20, pH 6,0) 1:20-as hígítást készítettünk, majd 5 µM FRETS-VWF73 szubsztrát oldattal összemértük (20 µl mindkét oldatból). 37 °C-on 1 órán keresztül két percenként, 340 nm-es excitációs és 460 nm-es emissziós hullámhosszon kinetikus fluorimetriás mérést végeztünk. A kapott fluoreszcencia értékeket az idő függvényében ábrázoltuk, lineáris regresszióval meghatároztuk a meredekséget. Tíz egészséges véradó poolozott citrátos plazmájából készült hígítási sorozat meredekségi értékeit a hígítás százalékának függvényében ábrázoltuk. Az így készített standard görbe (100%:
hígítás nélküli normál plazma, 0%: vak, reakció puffer) segítségével határoztuk meg az ismeretlen plazmák aktivitását. Az eredményeket a poolozott egészséges véradó plazma aktivitásának százalékos arányában adtuk meg.
3.6. A vérplazma von Willebrand faktor antigén szintjének meghatározása
A von Willebrand faktor antigén szintjét citrátos plazmából ELISA (enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat) módszer segítségével határoztuk meg, kereskedelmi forgalomban kapható antitestek (Dakopatts, Glostrup, Dánia) segítségével. Mikrotiter lemezeket (Immunoplate Maxisorb, Nunc, Roskilde, Dánia) 1:800 arányban nátrium-hidrogénkarbonát pufferben hígított (pH 9,6) humán von Willebrand faktor-ellenes poliklonális nyúl antitestekkel fedtünk. Egy éjszakán át tartó 4 °C-os inkubálás és mosás (TBS-T: Tris-pufferelt fiziológiás sóoldat, 0,05% Tween-20 tartalommal) után a lemezeket a hozzáadott 1:500 arányban hígított plazmamintákkal 2 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ismételt mosás (TBS-T) után torma peroxidázzal konjugált humán von Willebrand faktor-ellenes poliklonális nyúl antitestekkel 1 órán át inkubáltuk a lemezeket, majd orto-feniléndiamin hozzáadása után
492 nm-es hullámhosszon mértük meg az optikai denzitást. Az eredményeket 10 egészséges véradó poolozott plazmájában mért érték százalékos arányában adtuk meg.
3.7. A von Willebrand faktor multimer szerkezetének vizsgálata
A von Willebrand faktor multimer mintázatának meghatározása nátrium-dodecil-szulfát (SDS)-agaróz gél elektroforézis útján történt EDTA-val antikoagulált plazmamintákban. Az elektroforézist alacsony felbontású (0,8%-os) agaróz gélen (Seakem HGT, Lonza, Basel, Svájc) végeztük 6 órán keresztül 20 mA/gél áramerősséggel 18 °C hőmérsékleten, Tris-borát puffer alkalmazásával. A fehérjéket elektroblot módszerrel vittük át a polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). A nagy molekulatömegű von Willebrand faktor multimerek transzferét 1 mM β-merkaptoetanollal 10 percig történő kezeléssel (merkaptolízis) segítettük elő a blottolás előtt (152). A von Willebrand faktort torma peroxidázzal jelölt humán von Willebrand faktor-ellenes poliklonális nyúl antitest (DakoCytomation, Glostrup, Dánia) és diaminobenzidin (DAB) szubsztrát segítségével vizualizáltuk. A kvantitatív multimer analízist GS-800 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia, USA) denzitométeren QuantityOne szoftver (Bio-Rad Laboratories) alkalmazásával végeztük, és az eredményt a nagy multimerek (>20 mer) százalékos arányában adtuk meg (153).
3.8. A szérum citokin, leptin és a plazma oszteopontin szintek vizsgálata
Az interleukin (IL)-1ß, 1 receptor antagonista (1ra), 2, 4, 6, 8, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-18, interferon (IFN)-γ, tumor nekrózis faktor (TNF)-α, interferon-γ-indukált protein (IP)-10, monocita kemotaktikus protein (MCP)-1, intercelluláris adhéziós molekula (ICAM)-1 és vaszkuláris sejtadhéziós molekula (VCAM)-1 szérumszintjeit multiplex szuszpenziós array útján (Plex, Cat. No. X500317TGY és XF0000ZGAI) Bio-Plex 200 analizátor segítségével mértük meg (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia, USA). A szérum IL-17A, transzformáló növekedési faktor (TGF)-β1, leptin és a plazma oszteopontin szintjeit ELISA módszerrel határoztuk meg (eBioscience, San Diego, Kalifornia, USA, Cat. No. BMS2017HS; DRG International, Mountainside, New Jersey, USA, Cat. No.
EIA-1864, EIA-2395, EIA-3116), a gyártó utasításainak megfelelően.
A multiplex citokin meghatározás lépései:
A vizsgálatokat diluenssel (Bio-Plex Human Serum Diluent) négyszeresre hígított szérummintákból végeztük.
1. A színkódolású analit-specifikus mikrorészecske-koncentrátumokat, reagenseket, mintákat és standardokat a leírás szerint előkészítettük. A lemezt 100 µl mosópuffer hozzáadásával előre megnedvesítettük, majd eltávolítottuk a folyadékot a mérőhely alján levő szűrőn át, a mikrolemezhez tervezett vákuumelosztóval.
2. 50 µl hígított mikrorészecske keveréket adtunk mindegyik mérőhelyre.
3. 50 µl standardot vagy hígított mintát adtunk az adott mérőhelyre. 3 órán keresztül mikrolemezrázón inkubáltuk.
4. A lemez háromszori mosását követően (minden mintahelyet 100 µl mosópufferrel mostunk) 50 µl hígított Biotin Antitest koktélt adtunk mindegyik mérőhelyre, majd a lemezt rázókészüléken inkubáltuk 1 órán át.
5. A háromszori mosást megismételtük, majd 50 µl hígított sztreptavidin-fikoeritrin konjugátumot (Streptavidin-PE) adtunk mindegyik mintahelyre. 30 percen át rázón inkubáltuk.
6. A mosást háromszor megismételtük és végül 100 µl mosópuffert adtunk mindegyik mintahelyre, majd 2 percig inkubáltuk.
7. Bio-Plex 200 analizátor felhasználásával az eredményt 90 percen belül olvastuk le. A mérés során a készülék kétféle lézert használ: az egyik lézer mikrorészecske-specifikus, amely meghatározza, hogy melyik analitot vizsgáljuk, a másik lézer a fikoeritrin által adott szignál erősségét jelzi, amely egyenesen arányos a megkötött analit mennyiségével. Az egyes minták citokin koncentrációját a Bio-Plex ManagerTM szoftver a standard hígítási sor alapján számította ki.
3.9. A 70 kDa molekulatömegű hősokkfehérje (Hsp70, HSPA1A) szérumszintjének meghatározása
A Hsp70 (HSPA1A) szérumszintjét az R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA, Cat. No. DYC1663E) ELISA kitjével határoztuk meg. A mérés során az egér anti-humán Hsp70 monoklonális antitesttel kezelt (100 µl/lyuk; 2 µg/ml; bikarbonát pufferben (pH 9,5) egy éjszakán át 4 °C-on) ELISA lemezt háromszori mosás (PBS (foszfáttal pufferelt fiziológiás sóoldat), 0,1% Tween 20) és a nem-specifikus kötőhelyek blokkolása (200 µl PBS, 0,5% zselatin, 0,1% Tween 20, 1 órán át, szobahőmérsékleten) után hígítatlan vizsgálati szérummintával inkubáltuk (100 µl/lyuk; 2 órán át, szobahőmérsékleten). Újabb mosási ciklust követően biotinnal jelzett nyúl anti-humán Hsp70 monoklonális antitesttel (100 µl/lyuk; 0,5 µg/ml; PBS-zselatinban, 1,5 órán át, szobahőn) és sztreptavidin-torma peroxidáz komplexszel (mosás után; 1:200; PBS-zselatinban, 20 percig, szobahőn) detektáltuk a
lemezhez kötődött Hsp70 mennyiségét. Standardként rekombináns humán Hsp70 hígítási sorát használtuk (0-10 ng/ml). A lemezeket mosást követően 100 µl orto-feniléndiamin (OPD, Sigma-Aldrich) szubsztráttal hívtuk elő, az optikai denzitást 490 nm-en (referencia 620 nm) mértük.
3.10. A hősokkfehérjék elleni antitestek szérumszintjének meghatározása
Az anti-Hsp70 (HSPA1A) IgG antitestek szérumszintjét ELISA módszerrel mértük meg. A mikrotiter lemezeket 0,1 µg/lyuk rekombináns humán Hsp70 antigénekkel (StressGen, Victoria, Kanada, SPP-755) fedtük bikarbonát pufferben (pH 9,6, 100 µl/lyuk, 4
°C-on egy éjszakán át). Mosás és a nem-specifikus kötőhelyek blokkolása (PBS, 0,5%
zselatin, 1 órán át, szobahőmérsékleten) után 1:100 arányban hígított szérummintával 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk a lemezeket (100 µl/lyuk; PBS, 0,5% zselatin, 0,05%
Tween 20 oldatban). Mosást követően γ-lánc-specifikus, peroxidázzal konjugált, nyúlban termelt anti-humán IgG antitestekkel (Sigma-Aldrich) jelöltük az anti-Hsp70 antitestek kötődését (100 µl, 1:6000 hígítás PBS-zselatin-Tween 20 oldatban, 1 óra inkubálás szobahőmérsékleten). Ismételt mosást követően kecskében termelt, peroxidázzal konjugált nyúl IgG elleni antitestet (Sigma-Aldrich) adtunk a lemezekhez a jelölés felerősítésére. A lemezeket mosást követően orto-feniléndiamin szubsztráttal hívtuk elő, az optikai denzitást 490 nm-en (referencia 620 nm) mértük. Az antitest koncentrációt önkényes egység/ml-ben (Arbitrary Unit – AU/ml) adtuk meg, melyet anti-Hsp70 antitesteket magas koncentrációban tartalmazó humán szérum hígítási sorából készített standard görbe alapján számoltunk ki.
Az anti-Hsp60 és anti-Hsp65 IgG antitestek szérumszintjét ELISA módszerrel határoztuk meg. A lemezeket rekombináns humán Hsp60 (StressGen, SPP-740) vagy rekombináns Mycobacterium bovis Hsp65 (Lionex, Braunschweig, Németország, MA14) antigénekkel fedtük (0,1 µg/lyuk). Mosás és blokkolás (PBS, 0,5% zselatin) után 1:500 arányban hígított szérummintával 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk a lemezeket (100 µl/lyuk; PBS, 0,5% zselatin, 0,05% Tween 20 oldatban). A lemezekhez kötődött anti-Hsp60/65 antitestek mennyiségét peroxidázzal konjugált, γ-lánc-specifikus anti-humán IgG (Sigma-Aldrich) és orto-feniléndiamin hozzáadásával detektáltuk. A lemezek leolvasása és az antitest koncentrációkat tükröző optikai denzitások önkényes egység/ml-be történő átszámolása ugyanazzal a módszerrel történt, mint a Hsp70 elleni antitestek mérésénél.
3.12. A komplementrendszer vizsgálata
A C1rC1sC1-INH komplex plazmaszintjét ELISA módszerrel mértük meg. Mikrotiter lemezt (Nunc, Roskilde, Dánia) 1:500 hígítású, nyúlban termelt anti-humán C1-INH ellenanyaggal (Dako, Glostrup, Dánia) fedtünk, 16 órán át, 4 °C-on. Mosást (PBS, 0,1%
Tween 20, pH 7,4) követően a lemezt 1% marha szérum albumint (BSA) tartalmazó PBS oldattal blokkoltuk, majd 1:200 hígítású EDTA-s plazmamintákkal és standarddal (hőaggregált IgG-vel aktivált normál humán szérum, 1:500-1:32000 felező hígítási sora) inkubáltuk 1 órán át. Detektáló ellenanyagként 1:500 hígítású, kecskében termelt anti-humán C1s ellenanyagot (Atlantic Antibodies, Stillwater, Minnesota, USA) alkalmaztunk, majd másodlagos ellenanyagként 1:1000 hígítású, nyúlban termelt, peroxidázzal konjugált anti-kecske IgG ellenanyagot (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania, USA). A reakcióhoz ABTS (azino-bisz-etilbenzotiazolin-szulfonsav) szubsztrátot (Sigma-Aldrich) használtunk, és 0,2 M oxálsavval állítottuk le azt. Az optikai denzitás értékeket 405 és 492 nm-en olvastuk le. A minták C1rC1sC1-INH tartalmát egység/ml-ben fejeztük ki (1000 egység felel meg 1 ml hígítatlan, hőaggregált IgG-vel aktivált normál humán szérum C1rC1sC1-INH tartalmának).
A C3bBbP aktivációs komplex plazmaszintjét ELISA módszerrel határoztuk meg.
Mikrotiter lemezt (Nunc) 1:1000 hígítású, kecskében termelt anti-humán properdin-faktor B ellenanyaggal (Incstar Corporation, Stillwater, Minnesota, USA) fedtünk, 16 órán át, 4 °C-on.
Mosást (PBS, 0,1% Tween 20, pH 7,4) követően a lemezt 1% BSA-t tartalmazó PBS oldattal blokkoltuk, majd 1:10 hígítású EDTA-s plazmamintákkal és standarddal (zimozánnal aktivált normál humán szérum, 1:100-1:12800 hígítási sora) inkubáltuk 1 órán át. Detektáló ellenanyagként 1:2000 hígítású, biotinnal konjugált, nyúlban termelt anti-humán C3c (Dako) ellenanyagot alkalmaztunk, majd másodlagos ellenanyagként 1:1000 hígítású sztreptavidin-peroxidázt (Jackson ImmunoResearch). A reakcióhoz orto-feniléndiamin szubsztrátot használtunk, és 0,5 M kénsavval állítottuk le azt. Az optikai denzitás értékeket 492 és 620 nm-en olvastuk le. A minták C3bBbP tartalmát egység/ml-ben fejeztük ki (1000 egység felel meg 1 ml hígítatlan, zimozánnal aktivált normál humán szérum C3bBbP tartalmának).
Az MBL (mannóz-kötő lektin)-MASP-2 (MBL-asszociált szerin proteáz 2) komplex aktiválhatóságának mértékét Petersen és munkatársai C4-depozíción alapuló módszere alapján határoztuk meg (154), kisebb módosításokkal. Mikrotiter ELISA lemezeket (Nunc) 1 mg/ml Saccharomyces cerevisiae eredetű mannánnal fedtünk (Sigma-Aldrich, M7504) fedőpufferben (0,1 M Na2CO3, pH 9,6), 1 órán át, 37 °C-on. A lemezt háromszor mostuk blokkoló pufferrel (20mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM EDTA, 0,1% Tween 20, pH 7,4),
majd 2 órán át, 4 °C-on blokkoltuk. Háromszor mostuk a lemezt mosópufferrel (20mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM CaCl2, 0,1% Tween 20, pH 7,4), majd az MBL-MASP-2 komplexek kikötése érdekében 1 órán át, 4 °C-on inkubáltuk a hígító pufferben (40mM HEPES, 2 M NaCl, 10mM CaCl2, pH 7,4) 1:1 arányban hígított szérummintákkal (50 µl).
Standardként normál humán szérum keverék (25-50-75-100%) felező hígítási sorát alkalmaztuk. Ezt követően kétszer magas ionerejű (20mM HEPES, 1M NaCl, 5mM CaCl2, 0,1% Tween 20, pH 7,4), majd háromszor alacsony ionerejű mosópufferrel (20mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM CaCl2, 0,1% Tween 20, pH 7,4) mostuk a lemezt, és C4 pufferben (20 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5mM CaCl2, pH 7,4) 0,02 mg/ml humán szérumból tisztított C4 fehérjével inkubáltuk 1 órán át, 37 °C-on. Háromszori blokkoló pufferes mosást követően 1:1000 hígítású, kecskében termelt anti-humán C4 ellenanyaggal (DiaSorin, Stillwater, Minnesota, USA) inkubáltuk a lemezt 1 órán át, szobahőmérsékleten. Háromszori blokkoló pufferes mosást követően torma peroxidázzal jelölt 1:8000 hígítású kecske IgG elleni antitestet (Sigma-Aldrich) alkalmaztunk 1 órán át, szobahőmérsékleten. Három mosási lépést követően OPD szubsztrátot használtunk, majd 5 perc elteltével 0,5 M H2SO4 oldattal állítottuk le a színreakciót. Az optikai denzitás értékeket 492 és 620 nm-en olvastuk le. Az egyes mintákban a mannán hatására mért MBL-MASP-2 aktiválhatóság mértékét (melyet az elhasított exogén C4 mennyiségével jellemeztünk) a normál humán szérumra jellemző érték százalékában fejeztük ki.
A C4d, C3a és SC5b9 koncentrációját EDTA-s plazmamintákban a Quidel cég ELISA kitjeivel (San Diego, Kalifornia, USA, Cat. No. A008, A015, A029), míg a fikolin-2 és fikolin-3 plazmaszintjét a Hycult Biotech cég ELISA kitjeivel (Uden, Hollandia, Cat. No.
HK336 and HK340) határoztuk meg, a gyártó útmutatása szerint.
3.13. A szérum C-reaktív protein (CRP) koncentráció meghatározása
A szérum CRP szinteket ultraszenzitív, latex szemcsékkel érzékenyített immunoturbidimetriás eljárással mértük meg Cobas Integra 800 automatán a gyártó által forgalmazott kittel (Roche, Mannheim, Németország, Cat. No. 20764930). A humán CRP monoklonális anti-CRP antitestekkel fedett latex szemcsékhez agglutinálódott. A precipitátumot 552 nm-en turbidimetriával határoztuk meg.
3.14. A vérplazma szabad magzati DNS mennyiségének meghatározása
Fiú újszülöttek esetén az anyai plazmából szilícium-dioxid adszorpciós módszerrel kivontuk a DNS-t, ezt követően meghatároztuk a szabad magzati DNS mennyiségét az Y
kromoszóma szex-determináló regiójának (SRY) kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciójával (PCR). A DNS-t 400 µl EDTA-val antikoagulált plazmából vontuk ki High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Mannheim, Németország) segítségével, a gyártó előírásai alapján. A DNS-t 50 µl elúciós puffer oldattal mostuk ki, amelyből 1 µl-t használtunk mintaként a PCR reakcióhoz. A SYBR Green valós idejű PCR analízishez a LightCycler 1.0 készüléket alkalmaztuk (Roche, Mannheim, Németország). A keringésben található fiú magzati DNS kimutatásához az SRY gén következő primereit használtuk: előre 5’-GGC AAC GTC CAG GAT AGA GTG A-3’, hátra 5’-TGC TGA TCT CTG AGT TTC GCA TT-3’. A 10 µl térfogatú PCR reakcióelegy 1 µl DNS-t, 1-1 µl 2,5 pmol/l primert, 1 µl DNA Master SYBR Green I mixet (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit:
Taq polimeráz, dNTP, MgCl2) és 6 µl nukleázmentes vizet tartalmazott. A polimeráz láncreakció a következő program szerint zajlott: kezdő denaturáció 95 °C-on 8 percig, amit 40 ciklus denaturáció (95 °C-on 5 másodpercig), annealing (60 °C-on 10 másodpercig) és láncszintézis (72 °C-on 15 másodpercig) követett, majd 4 °C-ra történő hűtés zárt le. A plazmamintában jelenlevő szabad magzati DNS mennyiségének meghatározásához ismert koncentrációjú férfi genomiális DNS-el készített standard hígítási görbét használtunk.
3.15. A vérplazma malondialdehid és fibronektin szintjének meghatározása
A vérplazma malondialdehid szintjét tiobarbiturát alapú kolorimetriás eljárás útján mértük meg (155). A vizsgálat a 2-tiobarbitursav malondialdehiddel történő nukleofil hozzáadásán alapult savas kémhatáson (pH 2,0) és magas hőmérsékleten (100 °C). A kalibrációt a malondialdehid forrásaként 1,1,3,3-tetraethoxy-propán (Fluka, Buchs, Svájc) alkalmazásával végeztük. A plazma fibronektin koncentrációkat nefelometria (Dade Behring, Marburg, Németország) segítségével határoztuk meg a gyártói leírásnak megfelelően.
3.16. A limfociták intracelluláris VEGF-A expressziójának vizsgálata
A perifériás vérben található limfociták intracelluláris VEGF-A expresszióját áramlási citometriával határoztuk meg. Felolvasztást követően az izolált mononukleáris sejteket kétszer PBS oldatban mostuk, és az életképességüket tripánkék festék kizárással ellenőriztük (>90%). A nem-specifikus kötőhelyeket 10% egér szérummal blokkoltuk (10 percig, szobahőmérsékleten). A sejteket fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelölt anti-humán CD3 és fikoeritrin-cianin 5-tel (PC5) jelölt anti-humán CD56 vagy FITC-jelölt anti-humán CD8 és PC5-jelölt anti-humán CD4 monoklonális egér antitestekkel (BD Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA) inkubáltuk 15 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. Mosást követően a
vörösvérsejteket 1,5 ml 1X FACS Lysing Solution (BD Biosciences) oldattal lizáltuk, 10 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. Centrifugálást és a felülúszó eltávolítását követően 500 µl 1X FACS Permeabilizing Solution (BD Biosciences) oldattal inkubáltuk a sejteket 10 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. Kétszeri mosást követően a permeabilizált sejteket fikoeritrinnel (PE) jelölt egér anti-humán VEGF-A monoklonális antitesttel (R&D Systems) inkubáltuk 30 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. A nem-specifikus kötődés kimutatására PE-jelölt, izotípus-azonos egér immunglobulin (Ig) G2A antitestet (BD Pharmingen)
vörösvérsejteket 1,5 ml 1X FACS Lysing Solution (BD Biosciences) oldattal lizáltuk, 10 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. Centrifugálást és a felülúszó eltávolítását követően 500 µl 1X FACS Permeabilizing Solution (BD Biosciences) oldattal inkubáltuk a sejteket 10 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. Kétszeri mosást követően a permeabilizált sejteket fikoeritrinnel (PE) jelölt egér anti-humán VEGF-A monoklonális antitesttel (R&D Systems) inkubáltuk 30 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. A nem-specifikus kötődés kimutatására PE-jelölt, izotípus-azonos egér immunglobulin (Ig) G2A antitestet (BD Pharmingen)