In einem komplexen Organismus, der sich der kovalenten Modifizierung der DNA zur Stilllegung von Genen bedient, müssen Mechanismen vorhanden sein, diese bei Bedarf wieder zu entfernen und Gene zu reaktivieren. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen ist von höchstem Interesse, da ein detailliertes Verständnis die Chance bietet, die Steuerung der Zellentwicklung vollständig zu verstehen, sowie die Verbindung zwischen fehlerhafter Genexpression und diversen Krankheitsbildern im Detail aufzuklären. Insbesondere ist die gezielte Reprogrammierung von ausdifferenzierten Zellen in der regenerativen Medizin von großem Interesse.[76]

Nach der Befruchtung von Eizellen und zu bestimmten Zeitpunkten in der embryonalen Entwicklung werden große Teile des DNA-Methylierungsmusters sowohl aktiv als auch passiv entfernt und die Zellen somit reprogrammiert (siehe Abschnitt 1.3.3 und 1.4.3).[85, 88-90,

93, 96-98, 104-106] Im erwachsenen Individuum finden dagegen nur noch vereinzelte, Lokus-

spezifische, aktive Demethylierungsprozesse statt, wie z.B. in Neuronen.[76, 283-288]

Auf der Suche nach den zugrundeliegenden Mechanismen durchlief man in der Vergangenheit einige Rückschläge (Schema 10): Während in Pflanzen 5-Methylcytosin durch spezielle Glykosylasen (Dme/Ros1) direkt ausgeschnitten und per Basenexzisionsreparatur (BER) in unmodifiziertes dC umgewandelt werden kann,[56, 289-292] wurde in Säugetieren keine entsprechende Aktivität bis dato gefunden. Die dabei untersuchte Thymin-DNA-Glykosylase (Tdg) und das Methyl-CpG-bindende Protein Mbd4 hatten eine ~30 fach geringere Aktivität im Vergleich zu T:G-Fehlpaarungen.[293-297] Schlussfolgernd wurde die gezielte Desaminierung von 5-Methylcytosin untersucht, die zur Bildung des besseren Substrats von Tdg und Mbd4 führen würde. Als Cytosin-Deaminasen kamen Aid (activation-induced

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polypeptide) und sogar Dnmts in Frage.[298-304] Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass

Aid/Mbd4 in Zebrafisch-Embryos für DNA-Demethylierungsprozesse verantwortlich ist.[303]

Obwohl Aid und Apobec ferner auch in Oozyten, ES-Zellen und Urkeimzellen der Maus exprimiert werden,[300] sind sie hier eher nur für einen kleinen Teil der Demethylierung verantwortlich.[302] Aid-/-- und Apobec-/--Knockout-Mäuse zeigen zudem keine Entwicklungs- störungen, sind lebensfähig und fruchtbar.[305-308] Parallel hierzu konnte gezeigt werden, dass Dnmts in der Lage sind 5mdC zu desaminieren.[298-299] Dies soll mechanistisch über eine Absättigung der C(5)=C(6)-Doppelbindung und anschließendem nukleophilen Angriff von Wasser auf die C(4)-Position geschehen. Anzuzweifeln ist bei dieser Studie jedoch, dass die Desaminierung nicht durch direkte Messverfahren beobachtet wurde und die Reaktion nur dann erfolgte, wenn geringe Konzentrationen an SAM vorlagen, die im biologischen Kontext irrelevant sind.[76, 299]

Schema 10 | Mögliche aktive DNA-Demethylierungswege (grau hinterlegt). AP = apyrimidinische(/apurinische) Stelle.

Eine hohe Durchschlagskraft hatte deswegen 2009 die Entdeckung von Tahiliani et al., dass Tet-Enzyme die Methylgruppe von 5mdC effizient hydroxylieren können (siehe Abschnitt 1.4).[5] Sofort wurden die Möglichkeiten untersucht, wie 5hmdC als Intermediat weiter

abgebaut werden könnte. Eine Möglichkeit ergäbe sich in Analogie zu Pilzen, wie

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Die verantwortliche Dioxygenase T7h oxidiert Thymin nicht nur zu 5hmU sondern weiter zu 5fU und 5caU.[109] Dementsprechend könnte Tet die iterative Oxidation von 5hmdC zu 5fdC

und 5cadC bewerkstelligen (Schema 10). Alle drei Oxidationsprodukte könnten dann anschließend durch einen C(5)C(exo)-Bindungsbruch direkt, ohne Beteiligung von Reparaturenzymen, demodifiziert werden. Dies wurde in vitro für 5hmdC bereits gezeigt. Eine mutierte bakterielle DNA-Methyltransferase (HhalI) war hierzu in der Lage, die über die typische transiente Absättigung der C(5)=C(6)-Doppelbindung Formaldehyd freisetzte.[309-310] In Analogie könnten dementsprechend auch 5fdC und 5cadC unter Freisetzung von Ameisensäure bzw. Kohlenstoffdioxid demodifiziert werden, wobei die Decarboxylierung von 5cadC chemisch gesehen am plausibelsten erscheint.[3, 76, 110] So wird in Neurospora

crassa 5caU durch die Isoorotatdecarboxylase (Idc) decarboxyliert.[123-125]

Alternativ könnte 5hmdC, 5fdC und 5cadC auch über DNA-Reparaturmechanismen wie der BER entfernt werden (Schema 10). Da für 5hmdC keine Glykosylaseaktivität in Säugetieren gefunden wurde,[311-313] untersuchten Guo et al. den Zusammenhang der Desaminierung von 5hmdC zu 5hmdU durch Aid sowie Apobec und fand positive Hinweise für diesen Mechanismus im Gehirn.[313] Die anschließende Reparatur der Basenfehlpaarung soll dann durch die Glykosylase Smug1 oder Tdg eingeleitet werden.[312-313] Die Bedeutung von Tdg ist

dabei durch die embryonale Letalität von entsprechenden Knockout-Mäusen untermauert.[312] Der vorgeschlagene Desaminierungsmechanimus von Guo et al. konnte allerdings nicht als etabliert angesehen werden, da ein endgültiger Beweis durch direkte Verfolgung der Reaktionsintermediate und Produkte beispielsweise durch Massenspektrometrie-basierte Methoden ausstand.

2010 suchten Globisch et al. in Mäusegeweben nach 5fdC, 5cadC und 5hmdU per Umkehrphasenchromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (HPLC- HRMS). Jedoch konnte selbst im Gehirngewebe, welches sich durch höchste 5hmdC-Level auszeichnet, auch unter Verwendung größter DNA-Mengen keines dieser Intermediate detektiert werden. Dies wies zum einen auf die Stabilität von 5hmdC bzw. auf den transienten Charakter von 5fdC, 5cadC oder 5hmdU hin.[3] Demzufolge mussten in dieser Doktorarbeit sensitivere Methoden etabliert werden, um sich auf die Spur des DNA-Demethylierungs- mechanismus zu begeben.

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2 Aufgabenstellung

2009 wurde 5hmdC – als sechste Base des Genoms – in genomischer DNA im Gehirn und in Stammzellen gefunden. Diese Modifikation wird durch Tet-vermittelte Oxidation der Methylgruppe von 5mdC postreplikativ gebildet.[2, 5] Zu Beginn dieser Arbeit im Frühjahr 2011 deutete sich bereits an, dass 5hmdC eine weitere wichtige Rolle bei der epigenetischen Kontrolle der Zellentwicklung und Genexpression spielt. Darüber hinaus spekulierte man, dass 5hmdC ein Reaktionsintermediat eines lange gesuchten Mechanismus der aktiven DNA- Demethylierung darstellt. Dieser Mechanismus soll für die Demodifizierung und damit zur Reaktivierung von Genen verantwortlich sein, die durch Methylierung stillgelegt wurden.[107]

Das erste Ziel dieser Arbeit bestand darin, weitere Intermediate bzw. DNA-Modifikationen dieses unbekannten Mechanismus in genomischer DNA ausfindig zu machen. Zu den vielversprechenden Kandidaten zählten die höher oxidierten Derivate 5fdC und 5cadC sowie 5hmdU als Desaminierungsprodukt von 5hmdC (Schema 10).[3] Da diese Modifikationen mit den bisher verwendeten massenspektrometrischen (MS) Methoden im Arbeitskreis Carell nicht detektierbar waren,[3] sollten geeignete Derivatisierungsreaktionen zur Anwendung kommen und eine empfindlichere MS-Technologie etabliert werden. Als "Goldstandard" für dieses spurenanalytische Projekt war die Etablierung einer Methode geplant, bei der die Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektro- meter (UHPLC-ESI-MS/MS) gekoppelt wird. Für die massenspektrometrische Quantifi- zierung der potenziellen DNA-Modifikationen sollten ferner isotopenmarkierte interne Standards auf organisch-chemischem Wege synthetisiert werden.

Als nächstes Projekt stand die Untersuchung eines möglichen DNA-Demethylierungs- mechanismus im Vordergrund, welcher über CC-Bindungsbruchreaktionen von 5hmdC, 5fdC und 5cadC direkt unmodifiziertes dC wiederherstellen könnte. Hierfür sollten Isotopenverfolgungsexperimente im biologischen Milieu und chemische Modellsysteme entwickelt werden. Ferner sollte der Ursprung von genomischem 5hmdU quantitativ und durch metabolische Isotopenverfolgung untersucht werden. 5hmdU könnte sowohl per Desaminierung von 5hmdC als auch durch die Oxidation von dT entstehen.[3, 314] Da

potentielle Demethylierungsmechanismen per Basenexzisionsreparatur (BER) ablaufen könnten,[105, 283, 315] war für den Nachweis von abasischen Stellen die Synthese eines

Hydroxylamin-Reagenzes geplant. Dieses sollte unter milden Reaktionsbedingungen mit den abasischen Stellen ein stabiles Oxim bilden und hohe Detektionsempfindlichkeiten im Massenspektrometer erzielen.

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3 Veröffentlichte Arbeiten

3.1 Die Entdeckung von 5-Formylcytosin in embryonaler Stammzell-

Im Dokument Synthese und Analyse von natürlichen DNA-Modifikationen zur Aufklärung des epigenetischen DNA-Metabolismus (Seite 50-54)