Munkám során a bakteriális filamentumot felépítő flagellinmolekula terminális régióinak a szerepét vizsgáltam a fehérje polimerizációja során. Izotermális titrációs kalorimetriás és spektrofluoreszcenciás méréseket végeztem a flagellinmolekulával és a flagellumspecifikus exportrendszer FliH, FliI és FliS fehérjéivel.
Fontosabb eredményeim:
1. Fluoreszcens festékkel jelzett, különböző mértékben terminálisan csonkított flagellinmolekula fragmentumokkal FRET alkalmazásával végzett mérésekkel alátámasztottam azt a hipotézist, miszerint a filamentum végén levő flagellinmolekula szabad N-terminálisával képes kapcsolódni egy következő alegység ép C-terminálisához és ezen kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a folytonos filamentáris szerkezet kialakulás
2. Izotermális titrációs kaloriméterrel meghatároztam a FliI-FliH kötés sztöchiometriáját és moláris entalpiáját. Megállapítottam, hogy a két fehérje között csak gyenge kölcsönhatás létezik, ami nem támasztja alá a FliH irodalom szerinti szerepét a FliI ATP-áz szabályozására vonatkozóan.
3. Izotermális titrációs kaloriméterrel kimutattam, hogy a FliH a. igen erős specifikus Zn2+-ion kötő,
b. foszfátkötő tulajdonsággal rendelkezik.
4. Spektrofluoriméterel végzett kísérletekkel kimutattam, hogy a FliH foszfolipáz-C enzimatikus aktivitással rendelkezik.
5. Izotermális titrációs kaloriméterrel meghatároztam a FliS-flagellin kötés sztöchiometriáját és moláris entalpiáját. Mérési eredményeim az irodalommal ellentétben 1:1 arányú kötődést mutattak. A C-terminálisán csonkított fragmentummal való mérés összhangban az irodalmi adatokkal, miszerint a FliS fehérje a flagellin C-terminális régiójával hat kölcsön, nem mutatott
Theses
1. Various terminally truncated fragments of flagellin were labeled with fluorescent dyes, and their binding to the end of flagellar filaments was studied and compared by fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements. My results supported the Homma model of filament formation suggesting that the inner core of flagellar filament involves helical bundles formed by the interaction of N- and C-terminal regions of axially adjacent subunits.
2. The FliI–FliH complex was quantitatively characterized by isothermal titration calorimetry (ITC) to determine the stoichiometry and binding enthalpy. I found that FliS–FliC interaction is too weak to allow effective binding in the physiological concentration range.
3. I demonstrated by isothermal titration calorimetry that a. FliH can specifically bind zinc atoms,
b. FliH is a phosphate binding protein.
4. My spectrofluorimeter experiments demonstrated that FliH possesses phospholipase C activity.
5. I characterized the stoichiometry and binding enthalpy of the FliS–flagellin binding by isothermal titration calorimetry. The binding stoichiometry was found to be 1:1. Experiments with truncated FliC fragments demonstrated that the C-terminal disordered region of flagellin is essential for FliS binding.
A disszertáció alapját képező publikációk listája
Referált kiadványokban megjelent tudományos publikációk:
1. Adél Muskotál, Réka Király, Anett Sebestyén, Zoltán Gugolya, Barbara M. Végh, Ferenc Vonderviszt (2006) Interaction of FliS flagellar chaperone with flagellin.
FEBS Letters 580, 3916-3920
2. Sebestyén A., Gugolya Z., Jakab G., Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F.
(2005) The FliH component of the flagellar export apparatus is a multi-zinc enzyme with phospholipase activity FEBS Journal 272 (s1), F3-012P
3. Muskotál A., Király R., Sebestyén A., Végh B. M., Gugolya Z., Vonderviszt F.
(2005) Characterization of Salmonella FliS flagellar chaperone binding to flagellin FEBS Journal 272 (s1), G1-030P
4. Flachner B, Kovári Z, Varga A, Gugolya Z, Vonderviszt F, Náray-Szabó G and Vas M. (2004) Role of phosphate chain mobility of MgATP in completing the 3-phosphoglycerate kinase catalytic site: Binding, kinetic, and crystallographic studies with ATP and MgATP. BIOCHEMISTRY 43: 3436-3449
5. Gugolya Z., Muskotál A., Sebestyén A., Diószeghy Z. and Vonderviszt F. (2003) Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Lett 535, 66-70.
Előadás:
1. Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 8.
Munkaértekezlete (2003. május 12-15., Tihany): Vonderviszt Ferenc, Jakab Gábor, Diószeghy Zoltán, Gugolya Zoltán, Závodszky Péter: A FliH fehérje szerepe a flagellum-specifikus exportapparátus működésében.
2. MBFT Molekuláris Biofizikai Szekció (2003. április 25. Veszprém) Gugolya Zoltán, Jakab Gábor, Vonderviszt Ferenc: A flagellum-specifikus exportrendszer FliH komponensének kötődési tulajdonságai.
Poszter:
1. Muskotál A., Király R., Sebestyén A., Végh B. M., Gugolya Z., Vonderviszt F.:
Characterization of Salmonella FliS flagellar chaperone binding to flagellin. 30th FEBS Congress, 2-7 July 2005, Budapest
2. Sebestyén, Z. Gugolya, G. Jakab, Z. Diószeghy, P. Závodszky and F. Vonderviszt:
The FliH component of the flagellar export apparatus is a multi-zinc enzyme with phospholipase activity. 30th FEBS Congress, 2-7 July 2005, Budapest
3. Sebestyén Anett, Gugolya Zoltán, Jakab Gábor, Muskotál Adél, Diószeghy Zoltán, Závodszky Péter, Vonderviszt Ferenc: A flagellumspecifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással rendelkező multi-cink fehérje MBFT Kongresszusa, Debrecen, 2005. június 26-29.
4. Flachner Beáta, Varga Andrea, Kovári Zoltán, Gugolya Zoltán, Vonderviszt Ferenc, Náray-Szabó Gábor és Kazinczyné Vas Mária: A Mg2+ alapvető szerepe az ATP és ADP foszfoglicerát-kinázzal való specifikus kölcsönhatásában. Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 8. Munkaértekezlete (2003. május 12-15., Tihany)
5. Muskotál A.- Sebestyén A.- Gugolya Z.- Diószeghy Z.- Vonderviszt F.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. Keihanna International Conference on Molecular Biophysics., Kyoto, Japan, 2002. szept. 19-21.
6. Muskotál A, Sebestyén A, Gugolya Z, Diószeghy Z, Vonderviszt F: A flagellin molekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban.
Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 7.
Munkaértekezlete (2002. május 14-17., Keszthely)
7. Vonderviszt F.- Muskotál A.- Sebestyén A.- Gugolya Z.- Diószeghy Z.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. XIV.
International Biophysics Congress. Buenos Aires, Argentina 2002. ápr. 27.- máj. 1.
A disszertációhoz szervesen nem kapcsolódó publikációk listája
Folyóiratcikkek:
1. Z. Gugolya, Zs. Dosztányi, I. Simon: Interresidue interactions in protein classes, in:
Proteins. Structure, Function, and Genetics 27, pp. 360-366,1997
2. I. Simon, Z. Gugolya, Zs. Dosztányi: Interresidue interactions in protein classes Prog.Biophys.Molec.Biol. 65, pp.35, 1996 (abstract).
3. Gy. Rontó, S. Gáspár, P. Gróf, A. Bérces and Z. Gugolya: Ultraviolet Dosimetry in Outdoor Measurements Based on Bacteriophage T7 as a Biosensor. Photochemistry and Photobiology 59, 1994
Jegyzetek:
1. Gergelyi Gábor, Gugolya Zoltán, Palágyi Gábor, Kronome Gergely, Vonderviszt Ferenc, Demény Orsolya: Fizikai feladatgyűjtemény I. Mechanika. Veszprémi Egyetemi Kiadó, 2002
2. Gaal Sándor, Gergelyi Gábor, Gugolya Zoltán, Tóth József: Fizikai laboratóriumi gyakorlatok. Veszprémi Egyetemi Kiadó, 1998
Irodalomjegyzék
1. K. Namba és mts. (1997) Molecular architecture of bacterial flagellum Quart. Rev.
Biophys. 30, 1-65
2. Takeshi Ikeda és mts. (1993) Flagellar growth in a Filament-Less Salmonella FliD Mutant Supplemented with Purified Hook-Associated Protein 2 J. Biochem. 114, 39-44
3. Robert M. Macnab (1999) The Bacterial Flagellum: Reversible Rotary Propellor and Type III Export Apparatus J. Bacteriol. 7149-7153.
4. Vonderviszt F. és mts. (1992) Terminal disorder: A common structural feature of the axial proteins of the bacterial flagellum. J. Mol. Biol. 226, 575-579
5. F. Vonderviszt és mts. (1989) Terminal regions of flagellin are disordered in solution. J.
Mol. Biol. 209, 127-133.
6. S. Aizawa és mts. (1990) Termini of Salmonella flagellin are disordered and become organized upon polymerization into flagellar filament. J. Mol. Biol. 211, 673-677.
7. F. Vonderviszt és mts. (1990) Structural organization of flagellin. J. Mol. Biol. 214, 97-104.
8. F. Vonderviszt és mts. (1991) Role of the disordered terminal regions of flagellin in filament formation and stability J. Mol. Biol. 221, 1461-1474.
9. Y. Mimori-Kiyosue és mts. (1996) Direct interaction of fagellin termini essential for polymorphic ability of flagellar filament Biophysics 93, 15108-15113.
10. Y. Mimori-Kiyosue és mts. (1997) Locations of terminal segments of flagellin in the filament structure and their roles in polymerization and polymorphism. J. Mol. Biol. 270, 222-237.
11. Yamashita és mts. (1998) Structure and switching of bacterial flagellar filament studied by X-ray fiber diffraction. Nature Struct. Biol. 5, 125-132.
12. F. A. Samatey és mts. (2001) Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling Nature 410, 331-337.
13. Homma, M és mts. (1990)., DeRosier, D. J. & Macnab, R. M. Flagellar hook and hook-associated proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components of the flagellum. J. Mol. Biol. 213, 819−832
14. Robert M. Macnab (1999) The Bacterial Flagellum: Reversible Rotary Propellor and Type III Export Apparatus J. Bacteriol. 7149-7153
15. Tohru Minamino és mts. (1999) Components of the Salmonella Flagellar Export Apparatus and Classification of Export Substrates J. Bacteriol. 1388-1394.
16. George Dreyfus és mts. (1993) Genetic and Biochemical Analysis of Salmonella typhimurium FliI, a Flagellar Protein Related to the Catalytic Subunit of the F0F1 ATPase and to Virulence Proteins of Mammalian and Plant Pathogens J. of Bacteriol. 3131-3138 374-383
17. Frédéric Auvray és mts. (2002) Intrinsic Membrane Targeting of the Flagellar Export ATPase FliI: Interaction with Acidic Phopholipids and FliH J. Mol. Biol. 318, 941-950 18. Eugenia Silva Herzog és mts. (1999) Interaction of FliI, a component of the flagellar
export apparatus, with flagellin and hook protein Biochimica et Biophysica Acta 1431, 374-383
19. Tohru Minamino és mts. (2001) Proteolytic Analysis of the FliH/FliI Complex, the ATPase Component of the Type III Flagellar Export Apparatus of Salmonella J. Mol.
Biol. 312, 1027-1036
20. Tohru Minamino és mts. (2002) Structural Properties of FliH, an ATPase Regulatory Component of the Salmonella.Type III Flagellar Export Apparatus J. Mol. Biol. 322, 281-290
21. I. Kawagisi és mts. (1992) Subdivision of flagellar region III of the Escherichia coli and Salmonella typhimurium chromosomes and identification of two additional flagellar genes Journal of General Microbiology, 138 . 1051-1065.
22. Frédéric Auvray és mts. (2001) Flagellin Polymerisation Control by a Cytosolic Export Chaperone J. Mol. Biol.308, 221-229
23. A. J. Ozin és mts. (2003). The FliS chaperone selectively binds the disordered flagellin C-terminal D0 domain central to polymerisation. FEMS Microbiol. Letters. 219, 219-224.
24. ELTE Biokémiai Tanszék: Biokémia gyakorlati jegyzet, Budapest, 2003.
25. Biomolecule Chromatography PerSeptive Biosystem 1996, 165-174, 135-142 26. VP-ITC MicroCalorimeter User’s Manual 1998
27. http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD
28. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html?fileId1=1378gsh
29, Richard P. Haugland, Handbook of fluorescent probes and research chemicals, Sixth Edition
30. Jones DT (1999) Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring
31. http://www.piercenet.com/files/TR0006dh5-Extinction-coefficients.pdf
32. Gasteiger E. és mts. (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press.pp.
571-607
33. McGuffin LJ és mts. (2000) The PSIPRED protein structure prediction server.
Bioinformatics. 16, 404-405.
34. Raghava, G. P. S. (2000) Protein secondary structure prediction using nearest neighbor and neural network approach. CASP4: 75-76.
35. Combet C. és mts. (2000) NPS@: Network Protein Sequence Analysis, TIBS March Vol.
25, No 3 [291]:147-150,